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【求助】９５ｋｂ蛋白ＷＢ有Ｍａｒｋｅｒ没目的条带
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电泳：ｍａｒｋｅｒ跑的很漂亮，平齐，散开。
转膜：用的０.２２的膜，电流原来用１００ＭＡ，２ｈ，没有条带，ｍａｒｋｅｒ明显。
电流用３００ＭＡ，９０ｍｉｎ，结果一样，也没条带！
一抗４°过夜。二抗是红外二抗，湿转。
背景很淡，就是没条带。
胶做过考马斯染色，条带也是很清晰。
我个人觉得：１.蛋白有问题？
２．转膜问题最大？
３.膜应换成０.４５？
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最新回复
junhun (2013-12-02 17:05:43)
我建议你先跑一下蛋白胶看看，是否有你的目的蛋白。
同时，在做WB时，跑两块胶，一块用来检测上样没有问题。另一块继续做下去。最后的结果就知道到底是哪个阶段出问题了。再根据情况来找原因。
greenbee (2013-12-02 17:06:06)
问题出在膜上，0.22的膜只用于20KD以下的蛋白。否则都是用0.45的膜。另外，电流是不超过0.85mA/cm2，半干转不超过2h。
redbutterfly (2013-12-02 17:06:46)
QUOTE:
错。。022膜比0.45的膜截留的蛋白更多，包括你的95KD的蛋白。几点意见仅供参考和排除
1）抗体质量如何？--换另外公司抗体试一下
2）目的蛋白是否存在细胞特异性表达？--换几种不同细胞试一下
3）蛋白提取问题？--是否对照例如actin，出条带
4)转膜问题？丽春红染一下
89tongzijun (2013-12-02 17:07:15)
QUOTE:
1.抗体是用的进口抗体，单抗或者多抗，封闭时是否不同，我拿的牛奶封闭的。2.我提取的是组织的蛋白
3.我跑了两块胶，一块考马斯染色，条带很漂亮，脱色后很清晰，另一块接着孵抗体，什么也没。
4.我的内参是actin，买了，但是还没做。
5.我想知道转膜条件有什么需要改善的吗？
redbutterfly (2013-12-02 17:07:45)
QUOTE:
由于你的考马成功，说明是从砖模开始的步骤之后又问题，砖模是否成功，一个简单的立春红染色就能区分好坏。如果进一步actin以及其他内参能够检测条带，说明你的抗体有问题或者该蛋白不在该组织表达。进一步可以在其他文献已经报道的阳性细胞或组织中检测，若仍然你的抗体不工作，说明该抗体有问题。95KD的蛋白属于很好检测的分子量范围。相比细胞，组织蛋白的提取容易降解。从你目前提供的信息看，只能分析到此，你需要提供进一步的验证试验。更为简单的办法是，让有经验的实验室同行帮你做一次，就能判断是操作还是抗体带来的问题。
祝好运。
89tongzijun (2013-12-02 17:08:12)
QUOTE:
我转膜后，那转膜后的胶考马斯然后，什么也没有。组织蛋白保存条件怎么样比较好呢？redbutterfly (2013-12-02 17:08:35)
QUOTE:
如果两块胶是同时做的，而且转膜后的那块胶又进行靠马染色，染色显示没有蛋白，表明胶上的转过去了，是否过度转，穿过了膜的可能性有，不大，因为你给的转磨条件够用。总之一句化，简单点需要完成两件事，一个是检测内对照，然后看看丽春红染色。。若两者都没有问题，就是抗体问题，那个公司的抗体，不要告诉我是santa cruz的？是否提高了抗体的浓度？总之你看到的这个现象是一次结果还是多次试验？如果是一次，那不确定的因素更多。另外你做wb的经验多吗？我的意思是是否有检测其他蛋白成功的经历。在我看来WB的关键就是抗体的质量。我的组织蛋白直接冻在-20度，很长时间-80度。。
duoduo (2013-12-02 17:09:28)
我认为你可以用预染Marker一起来跑胶，这样在你转膜过程结束后，可以看胶上是否残留有预染Marker。若预染Marker已经转到膜上了，则胶残留很少的或者没有Marker了。这时你可以在膜上看到Marker。这样能够验证你转膜的条件是否合适，并根据转膜后观察到的结果来调整转膜参数。
至于你的抗体，我认为目前并不认为它有问题，毕竟商品化的东西，出问题的很少，除非你买来后，处置方面造成抗体出问题。
至于组织蛋白的保存条件，我认为，若你新提取的，直接拿来做WB就可以了，不用过于担心这方面问题。若蛋白提取出来，马上就不能用了，或者太过于娇气，需要多么复杂的条件来保存，那么做实验已经没有意义了。这样做出来的实验，结果经常会很不稳定。
换个人做或者让有经验的人用你现在的试剂做一下，我想也可能会发现你具体实验中的小问题。
至于膜的问题，我认为0.22微米的膜确实能留下更多的蛋白，分子量更大的蛋白。
wood533 (2013-12-02 17:10:27)
我认为可能是上样的蛋白含量有些低，你上100微克每孔试试。MARKER转的好，说明相应的目的蛋白也应该差不多，蛋白应该存在问题，你不行重新体蛋白，用新提的上样试一下。
wmp1234 (2013-12-02 17:11:11)
2.我提取的是组织的蛋白
3.我跑了两块胶，一块考马斯染色，条带很漂亮，脱色后很清晰，另一块接着孵抗体，什么也没。
4.我的内参是actin，买了，但是还没做。
5.我想知道转膜条件有什么需要改善的吗？
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小小建议：
1.你封闭液的浓度是多少？如果是磷酸化的抗体，可以用3%BSA封闭试试。一般的可以用5%的脱脂奶粉封闭1个小时。
2.组织蛋白提取应该没问题，蛋白定量后可以增加上样量。
3.优化WB各个步骤后还是不出，很有可能是抗体的问题。Abcam的抗体还有遭投诉的呢（周围一起做实验的好几个人订的不出结果，后来投诉之后退货的），也别太迷信进口抗体。
4.做个actin吧，一般很好出。
5.我们实验室一般半干恒流转，按面积*0.8，时间根据分子量大小，一般我做的130kDa的转2个小时，70，80的转90分钟，转得还OK吧！
仅供参考！呵呵！
33号 (2013-12-02 17:11:31)
硕士时经常做WB实验，确实很郁闷 ，有时候找了好久也找不到解决办法，说说自己的心得呵：
1、胶做过考马斯染色，条带也是很清晰-----这说明你的组织蛋白没有问题，前面的问题就可以排除了，主要是转膜和孵育的问题；
2、95KD的蛋白属于很常用的蛋白分子量，对于这种分子量稍大的蛋白，一般我用0.45的膜半干转膜，时间为1h10min,电压为膜面积的2.5-3倍；分析楼主，可以用立春红检验下蛋白是否转膜转过去了，以便排除转膜的问题；
3、最好用已经确定无误的阴极，阳极液，这个也很重要，曾经我就出现了这种问题；
4、相对来说3%-5%的脱脂奶粉封闭1h效果不错（个人观点）；
5、仔细阅读抗体说明书，有时候抗体只能用BSA或是奶粉的一种来稀释；
还是得慢慢摸索，别人说的只是参考，希望你能早日找到症结所在，实验顺利啊！！
hustwb (2013-12-02 17:12:29)
我做的是94kb大小的目的蛋白，用的是250MA，90MIN，跑出来的还可以，就是有杂带，你可以试试这个条件~
hustwb (2013-12-02 17:13:16)
1：用BSA封闭试试，我原来做过比较，用5%的脱脂奶粉封闭比用BSA背景干净，但也会使量少的蛋白不能显色，所以我会在寻求表达的时候用BSA，要背景干净结果好时用脱脂奶粉
2：丽春红染色可以证明你转膜是否成功
3:做了简单的ELISA证明你的抗体没问题
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