【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳

最新回复

• tuuu2 (2013-12-04 17:04:00)

  
  三、SDS-PAGE电泳篇
  Q11. SDS-PAGE电泳的基本原理？
  A11. SDS-PAGE凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=k–bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
  
  Q12. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？
  A12. 在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCl缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl–却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
  
  Q13. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
  A13. 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
  制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择Tris-HCl系统；
  TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
  十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
  
  Q14. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
  A14. 1. 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4°C冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
  2. 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法。
  
  Q15. SDS-PAGE样品如何处理？
  A15. 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
  1. 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或β-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
  2. 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，室温保温30min。
  3. 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

• tuuu2 (2013-12-04 17:09:04)

  
  内部的FQA内容，有些内容对新手还是很有意义的

• dog002 (2013-12-04 17:10:18)

  
  谢谢了！
  可是我做的不是SDS-PAGE,只是PAGE呢？
  是一样的吗？
  还有我看文章经常出现的例如：5×之类的数字符号，是什么意思？Marker的意思呢？

• tangxin_80 (2013-12-04 17:11:43)

  QUOTE:

  原帖由 dog002 于 2013-12-4 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  谢谢了！
  可是我做的不是SDS-PAGE,只是PAGE呢？
  是一样的吗？
  还有我看文章经常出现的例如：5×之类的数字符号，是什么意思？Marker的意思呢？

  5*是5倍的意思，通常配胶用的溶液都会先配成储液，用的时候再稀释。Marker就是分子量标准蛋白，点样的时候和你的样品一起跑，用来估算样品的分子量

• any333 (2013-12-04 17:12:02)

  
  很好，制好的胶在室温能存放4天吗

• remenb (2013-12-04 17:12:32)

  很好，制好的胶在室温能存放4天吗
  
  ==============
  
  要在4度存放

• flower-201 (2013-12-04 17:12:52)

  
  关键是防止晾干！！

• dog002 (2013-12-04 17:14:31)

  灌胶时要不要考虑温度

• dog002 (2013-12-04 17:15:06)

  我做的分离胶聚合差不多40分钟，但是浓缩胶聚合非常慢！用了我四个小时！
  不知道到底是什么问题？
  我浓缩胶配方如下：
  浓缩胶缓冲液 1.25ml
  浓缩胶母液 2.5ml
  核黄素 1.25ml
  蔗糖 5ml

• dog002 (2013-12-04 17:15:25)

  
  电极缓冲液可以收集以后下次再用吗？
  染色液也可以吗？

• dog002 (2013-12-04 17:18:13)

  
  我电泳跑完后，把凝胶拿出来后，放入染色液中，为什么没有出现谱带

• dog002 (2013-12-04 17:18:31)

  酯酶同工酶染色是用乙酸-1-萘脂系统还是用考马斯亮兰系统染色效果好些啊

• bring (2013-12-04 17:18:56)

  
  我做的是POD酶谱分析，染色采用醋酸联苯胺染色法，可是没有出现条带，而且胶也比较容易坏，是怎么回事呢