【求助】大分子western-blot！

最新回复

• junjie05 (2013-12-05 10:48:33)

  
  据说是很难做，我现在也想做大分子的蛋白，但是一直分离不出目的蛋白，甚至连全蛋白都跑不好，不知何原因，我用的事3.5%浓缩胶和6%分离胶，请高手指点一二。谢谢！

• 131415 (2013-12-05 10:49:10)

  
  我做的是目的蛋白273kd,8%的分离胶，5%的浓缩胶，正在进行中...........

• dongdongqiang (2013-12-05 10:49:31)

  
  273KD进行的怎么样了，

• ero11 (2013-12-05 10:50:44)

  
  8%的分离胶，5%的浓缩胶可以的啊，跑的时间长一点而已。转膜290mA，转过3h。中间换冰。大分子蛋白跑胶跑久了不是很齐，但带终归有的。电泳的时间可以长点，电压低点，这样不怎么发热。其实抗体好才是真的好。

• yjf1026 (2013-12-05 10:51:05)

  
  我跑8%，5%的胶，然后转膜用了两个小时40分钟，出来之后胶合膜上都没有彩色条带，我的转膜液是没有用甲醇的，而且sds为0.1%

• 131415 (2013-12-05 10:51:29)

  
  anybody knows what's going on? my result is similar to 陈月月...really need help

• JK.jon (2013-12-05 10:51:58)

  
  我来介绍一下我的经验，我做过400kd的蛋白，试过很多种方法，包括梯度胶等等，捣鼓了很久，最后发现一个简单的改变就可以轻松实现。
  1.将单叉和双叉的比例由1：29改为1：60，这将极大的增加胶联的孔径。
  2.分离胶用6%，浓缩胶4%，在剥胶的时候会发现胶非常的稀软，像鼻涕一样，但它毕竟是成型的，有一点耐心，小心的把它从板子上剥下来。
  3.电泳时间：选择分子量最大的预染MARKER，我用的是250kd，然后在电泳槽周围堆满冰，120ma使劲跑吧，跑两个小时换一次电泳液，一直跑到250kd的MARKER，离开胶释放到电泳液中，大概要用5个小时。这时候400kd的蛋白在离开浓缩胶边界0.5~1cm的地方。
  4.转膜：虽然湿转更好，但当时实验室只有半干转膜仪，于是加大电压1h，就OK了，时间再长就太热了。
  5.孵育抗体什么的都是一样的，但是建议蛋白上样量大一点，毕竟转膜不会转的很干净，会有损失的，而且大分子量的带一般不会很平齐，因为分子量大很多是由于糖基化修饰的缘故，每个蛋白不能保证都修饰的一模一样。
  
  这么做效果还是很好的，相关的文章已经在5分多的杂志发表了，祝大家实验顺利

• zhenxin (2013-12-05 10:52:38)

  
  请问一下冰栀子，你400Kb的蛋白半干转是恒压转还是恒流，如果是恒流，电流是如何选择。