【求助】碱性端蛋白点拖尾

最新回复

• laughing妹 (2013-12-05 16:33:03)

  
  此外这是pH4-7 13cm 的胶条 10% SDS-PAGE
  由于发现在碱性去还有大量蛋白，因而想改
  用3-10NL 胶条
  由于使用的是250μg 上样
  想进一步改为400μg 上样
  行吗？
  站友们有什么建议？

• ROSE李 (2013-12-05 16:34:04)

  
  因为从楼主的整体胶的分布情况来看， 酸性端和中性端都分的还不错， 因此聚焦过程应该还是很顺利的， 所以可以排除功率方面的影响，因此碱性端蛋白质点拖尾可能是下面2种情况的影响：
  
  1. 碱性端还原剂DTT量不足,蛋白质因还原剂不足而出现不同程度的氧化造成拖尾， 解决办法是加大水化液中添加的DTT的量（超过了没关系，因为我们一般胶条DTT加的都是过量的，楼主出现这种情况可能是因为DTT吸水很厉害， 所以有时候取不准， 因为就只有那么0.02mg， 吸潮了以后偏重可能导致DTT不够量， 特别楼主的碱性蛋白还特别多）。 如果有条件的话也可以采用GE公司的DESTREAK试剂或者用TBP代替DTT， 这两种方法都需要CUP-LOADING， 所以如果楼主不是专门做碱性蛋白的话不予以推荐。
  
  2. 另外一种可能性是TEMED失效或者量不足导致碱性端条纹， TEMED 在pH 3-10、中性及碱性pH条件下，可加速凝胶聚合，但在pH<5时则加速作用较少。 TEMED本身为碱性物质，在pH 4.5以上能扩展凝胶碱性端pH梯度，其扩增幅度与TEMED加入量有关。 实验表明 100ul的TEMED可使 pH 3.5-9.5的两性电解质载体扩展到pH 3.5-11的梯度范围, 因此TEMED对碱性蛋白质的分析极为有利。 解决的办法同样是过量TEMED， 或者是取新的， 特别臭的那种：）
  
  希望楼主能够通过以上2种试剂优化碱性端蛋白的分离。同时楼主准备选择3-10NL也非常正确， 至于上样量的话13CM的胶条上到400ug绝对没有问题。
  

• moonlight45 (2013-12-05 16:34:23)

  TEMED的功能还有这个啊

• wmp1234 (2013-12-05 16:35:19)

  
  我觉得跑的可以了，本来碱性端就是比较难聚的，可以 加Destreak

• uuooii (2013-12-05 16:35:39)

  看了好多你关于双向电泳图谱的解释，觉得很受用！谢谢啊！

• duoduo (2013-12-05 16:40:16)

  
  请问一下，Destreak 为什么要cuploading啊
  谢谢

• hustwb (2013-12-05 16:41:00)

  因为从楼主的整体胶的分布情况来看， 酸性端和中性端都分的还不错， 因此聚焦过程应该还是很顺利的， 所以可以排除功率方面的影响，因此碱性端蛋白质点拖尾可能是下面2种情况的影响：
  
  1. 碱性端还原剂DTT量不足,蛋白质因还原剂不足而出现不同程度的氧化造成拖尾， 解决办法是加大水化液中添加的DTT的量（超过了没关系，因为我们一般胶条DTT加的都是过量的，楼主出现这种情况可能是因为DTT吸水很厉害， 所以有时候取不准， 因为就只有那么0.02mg， 吸潮了以后偏重可能导致DTT不够量， 特别楼主的碱性蛋白还特别多）。 如果有条件的话也可以采用GE公司的DESTREAK试剂或者用TBP代替DTT， 这两种方法都需要CUP-LOADING， 所以如果楼主不是专门做碱性蛋白的话不予以推荐。
  
  2. 另外一种可能性是TEMED失效或者量不足导致碱性端条纹， TEMED 在pH 3-10、中性及碱性pH条件下，可加速凝胶聚合，但在pH<5时则加速作用较少。 TEMED本身为碱性物质，在pH 4.5以上能扩展凝胶碱性端pH梯度，其扩增幅度与TEMED加入量有关。 实验表明 100ul的TEMED可使 pH 3.5-9.5的两性电解质载体扩展到pH 3.5-11的梯度范围, 因此TEMED对碱性蛋白质的分析极为有利。 解决的办法同样是过量TEMED， 或者是取新的， 特别臭的那种：）
  
  希望楼主能够通过以上2种试剂优化碱性端蛋白的分离。同时楼主准备选择3-10NL也非常正确， 至于上样量的话13CM的胶条上到400ug绝对没有问题。