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【求助】GST标签蛋白不挂柱 洗脱前后洗脱buffer
大家好!我最近在纯化一种带GST标签的蛋白,诱导条件摸索的过程中发现它的包涵体的量很大,上清中有少量的蛋白。所以我就将包涵体用6M的尿素溶解后,复性,透析,过GST柱,结果发现:【求助】GST标签蛋白不挂柱 洗脱前后洗脱buffer
1 我的蛋白没有结合到柱料上,请问这可能是什么原因造成的?主要有哪些方面?
(开始我以为是包涵体没有复性完全,就将大量的超声裂解的上清过了一下柱子,还是所有的蛋白都直接流下来了;柱子我也用pH7.4的PBS平衡后才用的)
2 还有一个很奇怪的现象就是:我用洗脱buffer (50mM Tris,GSH,pH8.0)洗涤柱子的时候(本想将我的蛋白洗脱下来,没有电泳以前我以为蛋白结合上去了),流出液的pH值降得很低,在2.5左右。
大家有没有遇到这样的情况?能帮我分析一下这是什么原因么?
急需解决这两个问题,拜托了~
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最新回复
flower-201 (2013-12-06 17:22:43)
GST丢失活性,当然无法结合
fei1226com (2013-12-06 17:24:41)
我正准备上GST柱子纯化蛋白,不知道你的问题解决了没有。有问题多交流。
有几点你需要注意:
1、蛋白都是包涵体,这种情况最好先优化一下诱导条件,把诱导温度降下来,甚至可以16度诱导过夜,看看能不能提高蛋白的可溶性。
2、蛋白挂不住,出了填料失活之外,主要的是要注意上样的流速不要太快,尽可能慢点,快了结合不上。
INK (2013-12-06 17:25:14)
1. 过GST柱最好先和蛋白溶液孵育1-2小时,然后过柱子效果比直接流过好。
2. 洗脱液加还原性谷胱甘肽后pH下降很大,所以一定要把pH调回来。
nvdabing (2013-12-06 17:25:58)
谢谢大家!多多交流~
我再摸一下诱导的条件,看看能不能诱导成可溶的蛋白~
我是把GST柱先和蛋白溶液孵育了1.5小时,然后过的柱子;
“洗脱液加还原性谷胱甘肽后pH下降很大,所以一定要把pH调回来。”是指洗脱后将洗脱液的pH调过来么?我的洗脱液的pH本来是8.0。调回来有意义么? 还有就是它的pH为什么会变化这么大呢?
ii077345 (2013-12-06 17:26:17)
复性后要么GST失活了要么就是该标签被包埋了,可以考虑下换个标签,比如His什么的,可以在变性的条件下直接上柱,这种蛋白-beads之间的结合不依赖于酶活性以及融合蛋白的构象。
kulee (2013-12-06 17:26:55)
跟上样流速关系不是很大,你上样前脱盐了没,PH找的对么,蛋白是否还有活性
ROSE李 (2013-12-06 17:27:15)
KGZ564 (2013-12-06 17:27:41)
一般表达量很高的蛋白还会有部分是可溶表达的,可以大量表达后取上清纯化试试
ladyhuahua (2013-12-06 17:28:08)
我前些天刚做完一个GST标签的蛋白,对于你提出的问题,我的建议是:
1. 你的菌要做低温诱导表达,让其尽可能的可溶性表达。
2. 超声时,可以用20/50mM的Tris-HCl缓冲液,pH值8.0—9.0之间,这样使你的蛋白尽可能在上清中,然后调样品的pH值为7.5左右,再上GST柱子。
3. 解离时,50mM的Tris-HCl缓冲液+10/15mM的GSH,一定调溶液的pH值为8.0左右方可解离样品(因为缓冲液中加入GSH后,其pH值会下降很大)。
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