查看完整版本请点击这里：
【求助】做双向前一般都用什么方法测蛋白浓度？...
【求助】做双向前一般都用什么方法测蛋白浓度？...
在下为新手，请各位前辈指教。
我想提蛋白后做双向，先用BCA法测蛋白浓度，蛋白稀释8000倍后浓度仍为325.6ug/ml，绝对超出预计的量，不知为什么。我的裂解液配方为尿素8M、硫脲2M、CHAPS4%、PH3-10两性电解质0.5%、DTT为25mM，与说明书中的影响物质对比，只有尿素超过限制，可是稀释后也应该低于3M的要求了，不知是什么影响了该方法，请各位前辈指教。
ps，我用SDS-PAGE跑过所提蛋白，存在明显的条带，应该有蛋白的存在。
另外，大家做双向前一般都用什么方法测蛋白浓度？
[ 本帖最后由 guagua 于 2013-12-7 11:29 编辑 ]
查看完整版本请点击这里：
【求助】做双向前一般都用什么方法测蛋白浓度？...
【求助】做双向前一般都用什么方法测蛋白浓度？...
最新回复
lixi559 (2013-12-06 17:32:54)
325.6ug/ml?哪不是0.3ug/ul？这种程度的蛋白浓度不算高吧？
甚至说你这个浓度算是低的了 你做双向的话很可能浓度是低 了的
你的样品体积估计会过大 水化液可能都加不了了
guagua (2013-12-06 17:33:15)
前辈，325.6ug/ml是稀释8000倍后的浓度，我是说原浓度异常高，请各位前辈指点迷津。
各位前辈是用什么方法测蛋白浓度？Bradford?
zsxan1990 (2013-12-06 17:48:05)
你这个浓度太低了吧
lixi559 (2013-12-06 17:48:33)
LZ确定是样品稀释了8000倍而不是在测量过程中的稀释倍数？
实在确定不了 就拿样品跑个PAGE看看
另外如果LZ没有先测原来的样品浓度就直接稀释8000倍了来测的话，我只能说很难理解。。。
guagua (2013-12-06 17:50:49)
回复五楼：因为原样品加入BCA试剂就变成很深的紫色，颜色比标准曲线中最大的还深，测量不出结果，所以只能稀释了再测。我测了原样品、稀释100倍、1000倍、5000倍及8000倍的浓度，只有5000倍及8000倍出结果。PAGE跑过了，有条带。不过做双向需要确定上样量，所以想向前辈们求助。
lixi559 (2013-12-06 17:51:18)
就是很浪费了
youyou99 (2013-12-06 17:51:45)
蛋白抽提试剂中离子成分干扰了BCA的测试
kuohao17 (2013-12-06 17:52:10)
0.3ug/ul的浓度是没有意义的，为什么这么说？因为这个浓度很低，接近检测下限了，可能即使你用水来检测估计也能测出一定浓度出来，呵呵，但是这个信息可以作为参考，你把这个浓度提高10倍左右（即你的原样稀释800倍到1000倍的样子）检测一下，应该会有结果的。另外一个问题是，你的蛋白浓度测定的一些步骤是否有误？如果假设你的稀释8000倍的浓度测定是准确的话，那么原浓度应该是0.3*8000=2400ug/ul=2.4g/ml。这种蛋白浓度是不可能存在的，我们一般提取的蛋白浓度大概是1-10mg/ml的样子，你比常规浓度高1000倍，太吓人了，呵呵!
101010 (2013-12-06 17:52:31)
（说明书上写的）BCA法测定蛋白浓度需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。你的DTT 二硫苏糖醇为25mM的嘛，高于1mM。
mamamiya (2013-12-06 17:52:55)
Bradford法可以不受双向中那些试剂的影响，应该用这种方法。
30moonriver (2013-12-06 17:53:16)
应该用非干扰型蛋白定量试剂盒
【求助】做双向前一般都用什么方法测蛋白浓度？...