【求助】请教：湿法转膜的方法和滤纸的选择

最新回复

• jiushikeshui371 (2013-12-07 16:51:49)

  QUOTE:

  原帖由 shenkunjie 于 2013-12-7 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  请问湿法转膜的滤纸有什么要求吗？
  普通那种薄薄的层析滤纸要用几层啊？
  还有 如果方便的话 能把实验方法发给我吗？
  谢谢啦

  请问湿法转膜的滤纸有什么要求吗？
  没有要求，只要不是太薄就可以。
  
  普通那种薄薄的层析滤纸要用几层啊？
  滤纸的主要作用是起支持作用，具体放几层要视滤纸薄厚而定，要求是合上夹子，拉夹栓时候不要过紧或者不要过松即可。
  一般的普通滤纸3-5层每边即可。

• yysr238 (2013-12-07 16:52:10)

  
  湿法转膜对滤纸没有特殊要求，只要不太薄就可以；滤纸的主要作用是起支持作用，普通那种薄薄的层析滤纸一般每侧放3层就够了，只要合上夹子，拉夹栓时不会过紧或过松即可。
  具体步骤如下：
  电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
  ①用蒸馏水淋洗电极板，然后用不被吸收的纸巾揩干电极板上粘附的液滴；
  ②拿取凝胶、滤纸和硝酸纤维素滤膜时必须戴手套。因为皮肤上的油脂和分泌物会阻止蛋白质从凝胶向滤膜转移。
  ③把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水的水面上，借毛细作用使之从下往上湿润后，将之浸没于水中，浸泡5分钟以上以驱除留于滤膜上的气泡。随后浸泡入转移液中。
  PVDF膜则在甲醇中浸泡5min左右后转入转移液中。
  其余用品（滤膜、海绵）浸泡在转膜缓冲液中
  ④所有操作均在转膜缓冲液中进行，避免膜、胶移动，避免气泡
  ⑤戴上手套按如下方法安装转移装置：
  海绵 （阴极）
  ↓
  滤纸
  ↓
  胶
  ↓
  NC膜或PVDF膜
  ↓
  滤纸
  ↓
  海绵（阳极） 注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分
  将转膜架加紧，放入预装有转膜缓冲液的电泳槽内，加盖，放入冰盒，将槽埋入冰中进行转膜(200/250mA×2h；或：40-50mA过夜；
  或：根据凝胶面积按0.65mA／cm2接通电流，电转移1.5-2小时)

• yysr238 (2013-12-07 16:52:42)

  
  具体转膜时间、电流大小需根据你的目的蛋白而定
  希望有参考价值

• hyuu (2013-12-07 16:53:07)

  
  个人推测，滤纸的作用可能是以下几点
  1 楼上各位提到的支持作用，但个人觉得这不是最重要的
  2 过滤作用，在转膜过程中，转膜液可能混有杂质，海绵的碎片等等，通过滤纸可以过滤这些杂质。
  3 对海绵也有一定的净化作用，比如有的时候转膜时间过长，蛋白转过，这个时候可以再滤纸上面看到Marker，通过滤纸的净化，减少海绵被蛋白污染。
  
  滤纸放多少层，这个好像没有太多要求，1层，2层，3层我都放过，对实验结果好像没有太多影响

• 12xunmei (2013-12-07 16:53:35)

  根据凝胶面积按0.65mA／cm2接通电流，电转移1.5-2小时)
  
  ==============================================================================
  
  ？？
  按照这样计算的话，2*8cm的胶，才用10.4mA；8*8cm的胶，也才用41.6mA，这样能转出来吗？？
  我们一般都是用200-300mA湿转
  迷惑，请给与解答（难道是说半干转？）

• zhezhe (2013-12-07 16:54:08)

  这个应该是半干法转膜的公式~~

• vvmmoy (2013-12-07 16:54:30)

  
  滤纸是很重要的，除了上述的作用之外，我认为还有导电的作用·
  ① 当上下两层的滤纸过大，有接触的时候，会导致短路而使转膜失败
  ② 当滤纸过小的时候，只有有滤纸的部位，胶上的蛋白质才会顺利转到膜上去
  
  个人见解，还请更正

• remonte (2013-12-07 16:54:55)

  
  请问做湿转的bio-rad的滤纸在哪能买到啊？

• gemei0115 (2013-12-07 16:55:21)

  QUOTE:

  原帖由 remonte 于 2013-12-7 16:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  请问做湿转的bio-rad的滤纸在哪能买到啊？

  可以试试普通的滤纸，比较薄，但多叠加几层就可以了。不然像Sigma，Bio-Rad，3M都有差不多的滤纸，你可以咨询一下这些公司的代理商。