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【求助】为什么我的镍柱加了溶液后会变黄色
【求助】为什么我的镍柱加了溶液后会变黄色
各位师兄师姐:
我的包涵体是在8M脲素,0.1M DTT,20mMTris-cl, PH10.0里溶解的
然后我把新买的GE镍柱填料取出200ul 离心后去上清,用蒸馏水洗了2遍柱子,然后把柱子用8M脲素,0.1M DTT,20mMTris-cl, PH10.0溶液平衡 然后我把我的包涵体溶解的样品加入柱子后,发现镍柱变成黄色了 请问这是为什么呢
谢谢各位师兄师姐
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最新回复
kswl870 (2013-12-07 20:42:28)
DTT可以使Ni被还原,因此在用Ni柱纯化His标签的蛋白时要避免使用DTT,而应该考虑beta-巯基乙醇或TECP。
laughing妹 (2013-12-07 20:42:48)
Ni柱不能有DTT,一点点都不能有。可以用Ni-NTA可以耐受10mM左右的2-ME,如果是Ni-IDA就连2-ME都不能有。你那些被还原的填料可以在空气中缓慢氧化变回正常,然后用EDTA洗掉Ni,再用NiSO4重新上Ni就可以用了
豆荚 (2013-12-07 20:43:07)
chengjie79 (2013-12-07 20:43:32)
你好,我想问一下你的包涵体缓冲液为什么会选用pH10.0?可以解释一下吗?还有,你的目的蛋白定义为包涵体,我想问一下你超声后除了目的蛋白在沉淀里以外,还有别的很多蛋白在沉淀里面吗?大肠杆菌里面表达的蛋白大部分都应该是可溶的,所以绝大部分蛋白都应该在上清中,只有极少数的蛋白在沉淀,但是我做很多次很多蛋白质都在沉淀中,上清中很少,我觉得不是超声的问题,我2ml的菌30%功率,超4s停2s,总8min。交流一下,我之前做过一个pET28a的,做出来挺好的。现在在做32a的。
大尾巴 (2013-12-07 20:43:50)
"大肠杆菌里面表达的蛋白大部分都应该是可溶的,所以绝大部分蛋白都应该在上清中,只有极少数的蛋白在沉淀",楼上的,
这样的结论太草率,我们筛过上千种蛋白的表达测试,表达在沉淀的占了近一半。
具体问题具体分析吧,实验上没有一定是什么的,即使是相同的菌株,相同的实验方法,相同的操作者,不同的的操作环境,也可能产生完全不同的结果。
因此文献或者别人的结果也只能做参考,不能作为绝对的依据,如果自己各部分的操作都没有问题,就应该大胆地相信自己,并且根据自己得到的结果来设计实验。
HP007 (2013-12-07 20:44:35)
ffooll (2013-12-07 20:46:30)
这样的结论太草率,我们筛过上千种蛋白的表达测试,表达在沉淀的占了近一半。
具体问题具体分析吧,实验上没有一定是什么的,即使是相同的菌株,相同的实验方法,相同的操作者,不同的的操作环境,也可能产生完全不同的结果。
因此文献或者别人的结果也只能做参考,不能作为绝对的依据,如果自己各部分的操作都没有问题,就应该大胆地相信自己,并且根据自己得到的结果来设计实验。
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不好意思,我的意思是说大肠杆菌自身表达的蛋白基本上都是可溶的,如果你的重组蛋白表达的是包涵体的话,超声后,在沉淀中的蛋白应该主要是你的目的蛋白吧。
remenb (2013-12-07 20:47:03)
我用了10 mM 浓度,效果可以
wu11998866 (2013-12-07 20:48:10)
我们也出现了相同的问题,DTT浓度太高了,参考GE说明书,降低DTT浓度就可以了。
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