最新更新主题

【求助】急求：GST融合蛋白的纯化

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-12-07 20:55    作者: pulala    来源: 分析测试百科网

查看完整版本请点击这里：
【求助】急求：GST融合蛋白的纯化

最近在跟着师姐学习蛋白的表达与纯化。 首先想要问问的是，在大肠杆菌表达系统中，能不能表达磷酸化蛋白？？？我的目的蛋白需要磷酸化后，才成为我要的活性蛋白。
目的蛋白是一个蛋白激酶，叫Akt或者PKB，蛋白上面连接了一个GST的tag，表达出来之后，使用GE公司的GST纯化柱纯化目的蛋白，目的基因测序是正确的。
现在的问题是：1）在对上清液和沉淀同时做western检测的时候，在上清和沉淀之中，都检测到了GST融合蛋白，并且貌似沉淀还要多一些。我需要的是活性蛋白，所以现在师姐的意思是包涵体比较麻烦，需要复性，所以想只用上清液，不知道这样的效率高不高。
2）我们买了GE公司1mL的GST纯化柱，今天连接到实验室的LC系统中，发现在0.1mL/min的时候，柱压已经在40+bar了，但是买的纯化柱上面推荐的最大柱压是3bar。不知道这个怎么处理。 我现在想知道的是，是因为LC系统自身本来的压力都大，所以造成整个管路的压力都很大么？ 还要，GST纯化柱能承受的压力这么小，我应该怎么做呢？能接到液相系统么？

关于GST纯化柱，大家都是怎么使用的，请给些指导，谢谢！
查看完整版本请点击这里：
【求助】急求：GST融合蛋白的纯化

我也来说两句 查看全部回复

最新回复

  • nn255 (2013-12-07 20:55:22)

    原核表达一般没有修饰，比如蛋白的磷酸化位点！你在纯化之前，考染应该可以看到靶条带，再后续的纯化！

  • tangxin_80 (2013-12-07 20:55:45)


    嗯，宁愿多摇菌表达，都不愿做包涵体复性。
    诶，我的就是包涵体，一直复性不成功，郁闷之极。

  • nn255 (2013-12-07 20:56:21)

    什么目的啊？

  • pulala (2013-12-07 20:56:44)

    QUOTE:

    原帖由 nn255 于 2013-12-7 20:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    什么目的啊？
    想问一下 在大肠杆菌中表达的蛋白，可以被磷酸化么？

  • pulala (2013-12-07 20:57:02)

    QUOTE:

    原帖由 nn255 于 2013-12-7 20:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    原核表达一般没有修饰，比如蛋白的磷酸化位点！你在纯化之前，考染应该可以看到靶条带，再后续的纯化！
    我western看到GST融合蛋白是正确的，但是现在不知道蛋白会不会被磷酸化啊，如果不能被磷酸化，那么这个蛋白表达出来也就没有价值了..........

  • nn255 (2013-12-07 20:58:05)

    没听说过原核表达的蛋白还能被磷酸化

  • boom (2013-12-07 20:58:22)


    抗GST鼠单抗(HRP conjugated) 你可以用一下，我可以帮你联系一下货源。需要联系。

  • fox_79 (2013-12-07 20:58:44)


    其实不一定用可以连接纯化系统使用的小柱，可以使用重力柱，我们一直用上海生工的GST重力柱，纯化量大，效果好！
查看全部回复 我也来说两句
查看完整回复请点击这里：
【求助】急求：GST融合蛋白的纯化