【求助】原核表达，如何鉴定包涵体的存在

最新回复

• xueyouzhang (2013-12-07 21:13:12)

  
  细胞破碎以后高速离心，对沉淀用PBS重新悬浮，然后对上清和重新悬浮的沉淀本别处理，SDA-PAGE电泳分析，看你的目的蛋白是在上清还是在沉淀里面，若是在沉淀里面说明你的蛋白是以包涵体的形式表达。

• nikun230 (2013-12-07 21:13:32)

  赞同楼上的说法，如果是包涵体的话，那么用复性的方法，然后再做纯化啊。

• ilovegaga (2013-12-07 21:13:52)

  
  恩，谢谢楼上两位大侠的解答。有没有详细的复性纯化方法啊？Smile

• cocacola (2013-12-07 21:14:11)

  
  如果可以通过改变条件使目的蛋白表达在上清，对后续的实验好操作一点。
  
  至于包涵体复性，没有固定的可以套用的方法，下面是有篇介绍这方面技术的文章，可以看看，设计一些方法做一下测试，若有什么问题可以回来这里再讨论。

• popo520 (2013-12-07 21:14:30)

  可以超声破碎，跑SDS-PAGE 上清和沉淀分别点样

• 王小主 (2013-12-07 21:15:02)

  QUOTE:

  原帖由 cocacola 于 2013-12-7 21:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  如果可以通过改变条件使目的蛋白表达在上清，对后续的实验好操作一点。
  
  至于包涵体复性，没有固定的可以套用的方法，下面是有篇介绍这方面技术的文章，可以看看，设计一些方法做一下测试，若有什么问题可以回来这里再讨论。 ...

  你好，请教一个问题，谢谢！如果我的目的蛋白在上清液和包涵体（沉淀）中都存在的话，怎么处理？而且好像包涵体的量更大一些！
  当时超声裂解的时候，裂解液是12000g离心3min，不知道时间是不是有些短，因为我看有的说要15min。
  PS：我要的目的蛋白是一个酶，需要有活性。

• ilovegaga (2013-12-07 21:15:27)

  QUOTE:

  原帖由 王小主 于 2013-12-7 21:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  你好，请教一个问题，谢谢！如果我的目的蛋白在上清液和包涵体（沉淀）中都存在的话，怎么处理？而且好像包涵体的量更大一些！
  当时超声裂解的时候，裂解液是12000g离心3min，不知道时间是不是有些短，因为我看有的说要15min。
  PS：我要的 ...

  如果上清也有的话,优先选择上清中的蛋白啦,因为变性复性太麻烦,而且复性的时候很容易蛋白失活.另外你超声的时候加溶菌酶没有?这样可以排除下您超声不充分的因素.

• cocacola (2013-12-07 21:15:57)

  QUOTE:

  原帖由 王小主 于 2013-12-7 21:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  你好，请教一个问题，谢谢！如果我的目的蛋白在上清液和包涵体（沉淀）中都存在的话，怎么处理？而且好像包涵体的量更大一些！
  当时超声裂解的时候，裂解液是12000g离心3min，不知道时间是不是有些短，因为我看有的说要15min。
  PS：我要的 ...

  重组蛋白的原核表达，经常都会有这样上清、沉淀均存在的情况，如果是破菌后上清与沉淀都有，可以尝试一下使用不同的lysis buffer，比如更改一下 pH 值，调整一下盐浓度，有时候可以增加上清的量。
  感觉你离心的时间的确比较短，一般需用至30min，电泳前最好将上清样品过滤一下，以避免上清与沉淀没有完全分离开而影响了对结果的判断。
  若是上清与沉淀均有表达的情况，选择上清进行纯化是比较好的，毕竟这方面的可控性较强。
  当然也有例外，那就是上清的表达量太低了，且不易纯化，则需考虑沉淀复性；还有就是表达的某种酶对宿主本身的毒性较大，所以其若是可溶表达，感觉活性的保证不大，一般也得考虑复性。
  
  对于你所说的情况，我认为得先确定一下上清与沉淀的表达情况，就是电泳时制样应该更严谨些；
  若是确认上清表达，可先进行粗纯后进行活性测试再进行完整的实验设计。