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【求助】如何去盐更好

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-12-07 22:14    作者: =菓子=    来源: 分析测试百科网

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【求助】如何去盐更好
请教高手我的样品如何去盐更好：低丰度血浆样品，蛋白量约300ug,体积约60ul,因含盐浓度高达160mM，而我的下游分析要求去盐。如用超滤方法有矛盾，过大稀释可能使盐浓度很低，但会造成蛋白损失越大，过小稀释又怕去盐不好。过液相柱又怕蛋白损失，不知还有什么好办法既去盐效果佳蛋白损失又达最小？
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  • greenbee (2013-12-07 22:14:34)


    透析

    有用于小体积样品的透析管 GE，默克都有

  • =菓子= (2013-12-07 22:14:53)


    透析的样品损失情况不知怎样

  • qhyu (2013-12-07 22:15:14)

    小的脱盐柱，损失很少。

  • =菓子= (2013-12-07 22:15:32)


    小的脱盐柱，1.如反相柱样的，有最大蛋白载量，不合适吧？2.如有一Micro bio-spin,利用分子筛原理，快速，10分钟内搞定，不知是否有人用过这玩意？

  • =菓子= (2013-12-07 22:16:04)

    脱盐柱种类很多，象我的蛋白量约300ug,体积约60ul，截留分子量越低越好（尽量全要），有这方面经验的高人是否可推荐一种，谢谢了！

  • =菓子= (2013-12-07 22:16:37)

    用ZipTip脱盐不知蛋白损失情况怎样？

  • newway (2013-12-07 22:17:02)

    QUOTE:

    原帖由 =菓子= 于 2013-12-7 22:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    用ZipTip脱盐不知蛋白损失情况怎样？
    好像有截留1K以上的

    Mini Dialysis Kit 1 kDa cut-off, up to 250 μl 80-6483-75 （GE）

  • =菓子= (2013-12-07 22:17:26)


    还有Pierce的离心式脱盐柱，Zeba离心式脱盐柱，聚丙烯酰胺塑料脱盐柱，可惜他们的技术人员也说不出个一二，损失蛋白情况等如何，只有实践用过的人才会有真正的体会，论坛里有无人用过这些产品啊？

  • =菓子= (2013-12-07 22:17:51)

    除了截留分子量，透析管膜的吸附情况不知怎样？

  • xevin (2013-12-07 22:18:11)


    我前一段做了如下的实验：
    将25微克某重组蛋白(最小多聚体分子量>65kD）溶于0.5毫升PBS，过凝胶层析柱，收集液ELISA测定浓度后全部收集约10毫升，Millipore的30kD超滤管回收，浓缩至1毫升，再次ELISA测定，没有了。我个人认为是吸附在膜上了。书上说，截留分子量高的膜吸附较高，但没有具体数值，损失惨重，两千块的重组蛋白，一下子就消失了

  • =菓子= (2013-12-07 22:18:54)

    感谢xevin奉献自己宝贵的经验，截留分子量高的超滤管蛋白损失如此大让人触目惊心，但不知您用多少离心力，要提高回收率有一做法是把离心力设在最大离心力的一半。我最近的实验：低丰度血浆蛋白，蛋白量约300ug,体积60ul,但因其缓冲液中含有：
    8 M urea, 2% CHAPS，5% acetic acid，150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4.想去掉这些物质，并想最好把缓冲液替代为0.5M的TEAB.
    我预实验用3K的millipore超滤管，7000g，分别以1：4和1：7-8的0.5M的TEAB超滤替代，最后蛋白的回收率分别为75%和65%，当然特别耗时。但因每次加1：4的0.5M的TEAB超滤时并没有超滤浓缩至60ul（怕蛋白损失过大）,所以如8 M urea最后的浓度也不能以1/5的4次方相乘算，进一步想，就算每次浓缩回至60ul，且蛋白损失也可在接受范围，也不敢保证上面所列要去除的物质基本去除。
    故考虑以下手段不知哪个可选择：
    1.Zeba™ Desalt Spin Columns，先去盐，其他几种物质是否能去？
    2.mini dialysis unit 1K,200ul，先去盐，若不能去掉其他几种物质再超滤。
    3.Bio-Rad的Micro Bio-spin column去盐。
    4.Cleanup 疏水固相萃取柱，捕获蛋白，再用0.5M的TEAB去溶。
    希望论坛里的高手帮忙啊！

  • biabiade (2013-12-07 22:19:23)


    1和3相同，没有本质差别。

    4要考虑有机溶剂使样品失活可能。

    个人认为2最好。要考虑好截留分子量。

    脱盐不仅仅是脱去NaCl，而是所有的小分子都被去掉。准确地说应该叫缓冲液置换。

  • veiwu (2013-12-07 22:19:57)

    QUOTE:

    原帖由 biabiade 于 2013-12-7 22:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    1和3相同，没有本质差别。

    4要考虑有机溶剂使样品失活可能。

    个人认为2最好。要考虑好截留分子量。

    脱盐不仅仅是脱去NaCl，而是所有的小分子都被去掉。准确地说应该叫缓冲液置换。 ...
    您说1和3相同，但2最好，就是说透析最好么？我也是刚开始学做这方面，不过听一些师兄说透析是不是有些缺点比如耗时长、体积会增加较多等，相反zeba等柱子操作时间短、体积变化小、脱盐彻底，只是价格贵。是不是这样，我也不肯定，还请您指导，谢谢
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