【求助】关于Western blot 背景太深

最新回复

• purrr (2013-12-07 23:23:30)

  
  原因可能为：（1）一抗或/和二抗浓度太深。感觉你的一抗浓度太高了。（2）封闭时间短。（3）封闭液有问题。

• zwsyrt (2013-12-07 23:23:49)

  减低二抗浓度

• bongte (2013-12-07 23:24:12)

  如果是一抗浓度太高的话，我的条带颜色又不是很深哦，二抗的话1：3000Tubulin做出来刚刚好，谢谢

• xingyi08 (2013-12-07 23:24:38)

  
  1. 适当延长封闭时间
  2. 降低一二抗的比例和/或孵育时间

• orangecake (2013-12-07 23:25:07)

  我觉得可以在三方面改进：
  1.延长封闭时间，我一般25度封闭1.5小时。
  2.如果延长封闭时间还是不行，就更换封闭液，换个脱脂奶粉试试。
  3.ECL放光液的问题也不能忽视，可以换个试试。
  我的实验背景高就是ECL发光液的问题，换了个放光液就OK了。祝你好运！

• huifeng0516 (2013-12-07 23:25:27)

  降低二抗浓度~~~
  

• leifengta (2013-12-07 23:26:48)

  如果是一抗浓度太高的话，我的条带颜色又不是很深哦，二抗的话1：3000Tubulin做出来刚刚好，谢谢
  
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  我最近也碰到和你类似的问题，我做的目的蛋白是磷酸化蛋白，一抗1:2000，二抗1:2000。都用5%BSA封闭半个小时，结果目的蛋白背景很高，但条带很浅，还有杂带。但是我的内参actin非常清晰漂亮干净。实在是非常困惑，是我提的蛋白有问题吗，我的上样量也是50微克。
  请论坛的牛人帮帮我。

• zwsyrt (2013-12-07 23:27:28)

  
  我觉得你这是因为封闭时间太短。你的一抗浓度比较高，如果封闭的不够的话，容易有非特异的结合，可以用脱脂奶粉（一定要混匀），封闭2小时,在孵育二抗前用TBST洗两次后，再用牛奶封闭20至30分钟，我们是这样做的，效果还行。这样可以相对弥补抗体特异性不足，造成的目的蛋白周围的杂带和高背景，如果这样不能解决可以试试别的抗体

• bongte (2013-12-07 23:27:53)

  
  我觉得可能的原因还是一抗和二抗的浓度需要重新摸索。二抗的可能性更大些，不行可以改用进口二抗，我们这边1:20000挺好的。

• 水母 (2013-12-07 23:28:19)

  
  脱脂奶粉封闭1-2Hr效果不错
  另外，二抗浓度降到1:5000起试一试~我也是菜鸟，不知道能不能帮上你的忙~

• c86v (2013-12-07 23:28:57)

  封闭时间确实太短，不必担心会出不来条带，你一二抗浓度都那么高的，还可以减少抗体浓度