查看完整版本请点击这里:
【求助】细胞刮刮下细胞后可不可冻存?
【求助】细胞刮刮下细胞后可不可冻存?
大家好:
我想咨询一下,用细胞刮收集细胞时,用PBS洗两次后,直接刮取。然后离心,将细胞转移到EP管中,弃去上清,直接放在-80°C里冻存备用。这样做可不可以?有什么不妥?还是用胰酶消化好点?
希望各位能给点意见,谢谢!
查看完整版本请点击这里:
【求助】细胞刮刮下细胞后可不可冻存?
【求助】细胞刮刮下细胞后可不可冻存?
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-12-09 16:14 作者: idoww 来源: 分析测试百科网
最新回复
fei1226com (2013-12-09 16:14:49)
如果冻存来以后用来做IB/提RNA等的话可以。但是如果冻存后以后还复苏当然不行,其一是用细胞刮有一定的机械损伤,其二是没有保护剂(DMSO)等,细胞冻融过程中就全裂解掉了。
idoww (2013-12-09 16:15:11)
我想用这些冻存的细胞提蛋白,因为我需要的细胞的量比较多,所以多收集几次,然后一起来提蛋白,这样的话用胰酶或者用细胞刮将细胞收集起来应该没什么问题吧,用胰酶后者用细胞刮来收集细胞,那个方法对细胞的损害比较小呢,同时还不影响蛋白质的提取。谢谢楼上这位大哥
fei1226com (2013-12-09 16:15:53)
真要说对细胞的损害,那应该是胰酶比较小。不过单纯用细胞刮还是安全的,细胞刮本身的机械作用很难让细胞膜破裂,前提是你在冰上小心操作。而且你最好每次都分管收集,不要几次的都收集到一个管中。
tuuu2 (2013-12-09 16:16:13)
你提取蛋白,胰酶最好不要加,蛋白酶会水解你的蛋白或者带来杂蛋白。
idoww (2013-12-09 16:16:40)
QUOTE:
那就直接用细胞刮刮取就可以了哈。用细胞刮取离心后收集细胞,可不可以将细胞直接放在-80°C里,等用的时候再拿出来提取蛋白,谢谢哈gogo (2013-12-09 16:17:07)
将要收集平皿中的细胞用PBS洗两遍,然后再加入1mlPBS,用细胞刮子刮下来,用移液器转到EP管中,3000转,离心5min,弃掉PBS,将细胞沉淀放在-80度冰箱备用。
gogo (2013-12-09 16:17:36)
提蛋白时直接从-80度拿出来加入裂解液就行。注意冰上操作以防蛋白质降解
rxcc33 (2013-12-09 16:18:09)
idoww (2013-12-09 16:19:00)
QUOTE:
这样也可以呀,不过这种方法我很少见,可以试一下,你用这种方法做过没有?提取的蛋白量怎么样?idoww (2013-12-09 16:19:29)
QUOTE:
这些也全都是在冰上操作吗?PBS是不是用4度的,离心的时候也要在四度吧。EP管里的PBS肯定不会弃的那么彻底,可不可以用滤纸吸干?这样做应该对提取的蛋白没什么影响吧?谢谢各位帮忙。ending (2013-12-09 16:19:59)
==============================================================================================================
用过,否则我不会建议你用的,提取的蛋白量没什么问题,和你的细胞数有关,你只要收到5X105-106细胞数,总的裂解液用50-100微升,蛋白浓度可以达到5-10ug/ul.
【求助】细胞刮刮下细胞后可不可冻存?