【求助】超声破碎的几个问题

最新回复

• 12xunmei (2013-12-09 20:34:39)

  
  1：我国庆前刚做的200ml菌液的菌体，然后加入4ml PBS，未加溶菌酶，超声5s，间隔7s，30min,效果挺好的；
  2:超声时探头深入管底稍微留点空隙，过15min再看一下探头位置，因超声产热会把冰逐渐融化，使管子下沉；
  3：超声后离心发现有黑色沉淀可能超声时间长了
  以上拙见，仅作参考。

• ns5fan (2013-12-09 20:34:59)

  终于有人来帮忙回答问题了，先行谢过！
  你加入的裂解液这么少啊，是不是因为我的裂解液的体积太大了？你所说的效果好，是菌液变为澄清，还是通过其他方法检测的？

• purrr (2013-12-09 20:35:18)

  不知道你想的是什么菌，如果是想破菌得到上清或者包涵体的话，先把菌液离心，得到菌体沉淀，然后用buffer重悬，再破菌就行了，你200ml菌液也就得到1g左右的湿菌，10ml buffer重悬足够了，超声400w，9s，9s，5min 足够了！
  
  建议发帖前多搜索一下以前的帖子，有很多的！

• qqq111 (2013-12-09 20:36:10)

  
  我做超声破菌，一般把超声探头放到菌液深度的3/4到4/5的位置，并在玻璃杯四周用冰块固定玻璃杯的位置。因为超声过程中会产生大量的热量，四周的冰块会逐渐溶解，所以，第一次操作时需要密切关注玻璃杯的下沉情况，一旦发现玻璃杯下沉明显，超声探头的位置少于1/3时，调整到初始位置。
  至于超声的工作时间和间隔时间，因功率而定。如果功率是300w,工作时间和间隔时间可以试试三楼的5s和7s。如果效果不好，可以稍作调整，测试延长工作时间和间隔时间。一般问题不大。另外，超声总时间，一般30min左右足够了。
  加入的buffer，体积不要太大为宜。菌液太稀，超声效果可能不好。但菌液也不宜太稠。具体加入多少buffer合适，看你的200ml菌液里面含多少水分或者buffer。
  超声最后的结果，菌液应该看上去带点绿色，是多种可溶性蛋白混合后显示出来的天然颜色。如果目标蛋白是包涵体，菌液看上去应该有点浑浊状，不像目标蛋白是可溶性蛋白超声后显示出来的绿色。
  若有不明白的地方，或者更多问题，请继续讨论。
  

• sr9971 (2013-12-09 20:42:52)

  黑色物质是由于温度太高产生碳化，最后离心，黑色物质聚集在沉淀中。
  
  其实没离心前，就可以看到。比较好的超声效果是，超声完毕后，菌液均匀呈透明状（当然如果浓度很高，就不会像水一样，但是均匀是一定的）。如果有碳化，那么超声后的菌液会微微发黑。
  
  其实，蛋白纯化的超声破碎很简单，仅仅是需要将细菌破壁就可以了，不像ChIP等需要将交联后的DNA打碎到一定程度。
  
  超声破碎也不过就是注意防止过热而已，如果细菌没有破壁，大不了多超声几次。防止过热的话，自己实验中注意下就可以了。比如准备充足的冰水混合物；超声一段时间后，摇下离心管混匀菌液。很多东西需要自己思考一下，生物实验其实也是大同小异。

• nn255 (2013-12-09 20:43:24)

  关于细菌超声破碎的一些经验总结
  
  细菌工程菌胞内表达主要分为两种形式，一种是在强启动子条件下的高效表达，由于蛋白的过度表达，使蛋白不能及时有效折叠而发生无规则卷曲，以固体颗粒的形式堆积于胞间质中，这就是所说的包涵体，另外一种是间质内的可溶性表达，即可以发生正常折叠，具有生物活性。一般情况下，细菌只要被正常破壁就可以通过离心的形式将包涵体和可溶性表达的蛋白分离开。
  
  超声破碎的条件一般是300w，10s/10s，20分钟，具体条件可根据自身情况而定。
  
  超声前菌体的准备：菌液离心后，先用PBS将菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液体积的1/5-1/10加入裂解液重悬菌体，裂解液的成分：50mMTris-HCl, pH8.0, 2mM EDTA，100mM NaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%Triton X-100。切记冰浴超声！
  如何判断是否超声完全：根据网友的经验，一般有以下几个方面：
  1，外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。
  2，液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。
  3，高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用6,000 g 10 min, 比一般离心收集菌体的转速高一点）。 沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。
  4，染色：破碎后的菌液涂片，革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟，镜检。
  超声后加入核酸酶消除核酸对蛋白的污染。
  一些需要注意的问题：
  1，蛋白以包涵体形式表达，追求的是高破碎率，要求细胞碎片很小，而另一种蛋白是可溶形式表达，所以细胞碎片不能很小，两种情况要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分离。
  2，如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。
  3，超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
  4，尽量防止泡沫的产生。