调控基因表达的 miRNA

micro RNAs (miRNAs) 是一类长约22核苷酸的非编码的单链 RNA 分子，它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中。最早发现的是 lin-4 和它的靶 mRNA，即 lin-14。1993年，Lee 等人用经典的定位克隆的方法在线虫 (C. elegans) 中克隆了 lin-4 基因，并通过定点突变发现 lin-4 并不编码蛋白，而是产生一种小 RNA 分子。这种小 RNA 分子能以不完全互补的方式与其靶 mRNA 的3'非翻译端的特定区域相互作用来抑制 lin-14 的表达，最终导致 lin-14 蛋白质合成的减少，这种现象叫做转译抑制。通过转译抑制， lin-4 控制着 C．elegans 幼虫由 L1 期向 L2 期的转化。为什么一个只有22 nt 的 RNA 分子起着如此重要的调节作用？当时人们无法解释，只能认为是一种稀少的个别现象。但是，2000年第2个 miRNA let-7 及其人类和果蝇中同源物的发现改变了人们的看法， miRNA 可能是一类进化上保守的、在生命中起着重要调控作用的分子。它们能有效地抑制相关蛋白质的合成，导致靶 mRNA 的降解，或者其他形式的调节机制来抑制靶基因的表达，产生基因沉默。近年来发现 miRNA 可能在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用，miRNA 序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使其可能作为蛋白质编码 mRNA 的强有力的调节子。miRNA 的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在 RNA 水平对靶 mRNA 分子进行更迅速和有效的调节，展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。miRNA 的发现也是对中心法则中 RNA 次要的中介角色的重要补充，它将促使生物学家重新思考细胞遗传调控及其发育等方面的重要问题。  


1 miRNA 的产生  


　　迄今为止，在植物、线虫、果蝇和哺乳动物中已发现了一千多个 miRNA 基因(见表1)。这些 miRNA 基因首先在细胞核内转录成前体转录本 (pri-miRNA)，并被加工成前体 pre-miRNA，然后被转运到细胞质被加工成成熟的 miRNA (见图1)。Lee 等人第一次证明一大类 miRNA 由多聚酶Ⅱ (Pol Ⅱ )转录，而且一些 miRNA 的转录本(如 let-7 )具有5'帽和3' poly(A) 的结构，Pol Ⅱ 的抑制剂能够抑制 pri-miRNA 的积累，而 Pol Ⅱ 能与 miRNA 的启动子免疫共沉淀。Rodriguez 等人在基因组水平对 miRNA 的转录也进行了分析，哺乳动物中由内含子编码的 miRNA，其转录酶应该是 PolⅡ，Rodriguez 等人检测的 miRNA 与90个蛋白编码基因有关。但是并不能排除 miRNA 还有其他多聚酶，寻找与 miRNA 相关的其他聚合酶还有待进一步的研究。Pri-miRNA 在核内被 RNase Ⅲ 核酸酶 Drosha 加工成长约70 nt 的发夹状的 pre-miRNA。最近的报道指出，Drosha 和另外的一些成分(如人类中的 DGCR8 蛋白、果蝇中的 Pasha 蛋白)构成一个微小 RNA 处理器 (microprocessor) 的复合体，pri-miRNA 在这个 microprocessor 中被加工成 pre-miRNA。关于在 pri-miRNA 之前 miRNA 基因的转录本是如何加工的，人们所知甚少。线虫 miRNA 基因 let-7 前体是一个相对较长，且具有 poly(A) 结构，Bracht 等人发现 let-7 转录本经历一个反式剪辑 (trans-splicing) 的过程，生成一个叫做 SL1RNA(spliced leader1) 的中间体。pre-miRNA 在 Exportin5 的帮助下从核进入胞质内，这个过程还需要一个 G 蛋白因子 Ran 参与。能与 exportin5 结合的 pre-miRNA 必须具有大于16 nt 配对的茎和3'末端有2个悬垂碱基的结构特点，末端如果是5'悬垂碱基将会抑制 exportin5 对它的转运。胞质中 pre-miRNA 在 Dicer 酶的作用下，被切割成双链的 miRNA：miRNA* 配对分子，然后成熟的 miRNA 分子被解链，单链的 miRNA 进入一个核糖蛋白复合体 miRNP (也叫 RISC)，miRNA 通过与靶基因的3' UTR 区互补配对，指导 miRNP 复合体对靶基因 mRNA 进行切割或者翻译抑制。  


2 寻找 miRNA 基因  


2.1 克隆方法寻找 miRNA 基因  


　　2001年 miRNA 研究开始飞速发展。Lagos-Quintana 等人设计出一种专门克隆小片段 RNA 的方法(见图1(a))，在2 h 的果蝇胚胎的裂解液里和 Hela 细胞的总 RNA 中克隆了37个新的 miRNA 基因。Lau 等人用稍微改进的克隆方法在线虫中找到了55个 miRNA 基因。Lee 等人运用生物信息学和 cDNA 文库相结合的方法找到了13个 miRNA。随后掀起了寻找 miRNA 基因的热潮。Lagos-Quintana 等人继续他们寻找 miRNA 基因的工作，2002年和2003年用同样的方法分别在小鼠和人特异组织中克隆了34和31个新的 miRNA，并提出由于在克隆中已知的 miRNA 重复出现和 rRNA 的干扰，用同样的克隆方法找到新的 miRNA 会越来越难，这与后来 Lim 等人用 MiRscan 计算机程序估计人类中只剩下40个未知 miRNA 基因的结论一致。近来，寻找 miRNA 的方法越来越成熟，Ambros 等人对克隆寻找 miRNA 的方法进行了总结。  


　　继而，人们将寻找 miRNA 基因的目光转向特异的组织和发育的特异阶段。Mourelatos 等人用小片段克隆的方法在 HeLa 细胞中克隆了31个 miRNA，Houbavity 等人在小鼠 ES 细胞中克隆了15个 miRNA，Dostie 等人和 Kim 等人在哺乳动物神经细胞中分别找到了53和40个 miRNA，Ambros 等人在线虫中又找到21个 miRNA，Aravin 等人在果蝇的不同发育阶段找到了63个 miRNA，Wang 等人在籼稻中找到了20个 miRNA 基因。Pfeffer 等人在 EB 病毒的基因组中，找到5个编码 miRNA 的基因，这为 miRNA 基因家族添加了病毒中的成员。最近研究人员又在另3种病毒中找到了29个病毒 miRNA。Suh 等人在人胚胎干细胞中找到了36个 miRNA 基因，这些 miRNA 随着胚胎的发育表达量逐渐减少。Seitz 等人在人的 14q32 区域找到46个 miRNA 基因，发现它们多数在人的胚胎中表达，只由母性染色体表达，并且受到上游200 kb 处的一个甲基化区域 (IG-DMR) 调节。Kasashima 等人运用克隆的方法检测了 TPA 诱导人白血病细胞 HL-60 分化前后 miRNA 表达谱的变化，找到了3个新的 miRNA，并发现不同 miRNA 在分化前后表达量不同。现在科学家们已在不同的种属中克隆了大量的新 miRNA 基因。  


2.2 检测 miRNA 表达的方法  


　　检测 miRNA 最常用和直接的方法是 Northern 杂交，除此之外，还有 RT-PCR，液相杂交和基因芯片技术等。Lee 等人通过 Drosha-siRNA 下调 Drosha，抑制 pri-miRNA 的加工，再用 RT-PCR 的方法检测 miRNA 的表达。Sempere 等人通过 Northern 杂交的方法对已知的119个 miRNA 基因的表达做了检测，发现有一些是在特异的组织表达，有一些只是在不同组织的表达量不一样，而在脑组织表达的 miRNA 的作用方式表明这些 miRNA 与脑神经元的分化相关。 Allawi 等人将荧光方法引入 miRNA 的研究中，设计出一种新的方法叫“Modified Invader”分析，可快速而灵敏地分析 miRNA，能从50～100 ng 总 RNA 或者是1000个细胞的裂解液中检测到目的 miRNA。  


　　miRNA 基因芯片技术是一种更理想的快速有效的检测 miRNA 表达图谱的方法。这一方法被 Liu 等人首次报道用来检测 miRNA 在不同肿瘤细胞中的表达图谱，245个哺乳动物的 miRNA 被检测了，结果的重复性很好，而且被 Northern 杂交、RT-PCR 所证实。之后，Esau 等人运用 miRNA 芯片技术，检测细胞内的 miRNA 表达图谱，并且找到了 miR-143 和它的靶基因。Calin 等人通过 miRNA 芯片技术，比较了哺乳动物中 B 细胞淋巴瘤和正常细胞中 miRNA 的表达图谱，为 miRNA 在肿瘤临床应用中，提出了新的思路。Miska 等人运用 miRNA 芯片检测了小鼠脑发育中138个 miRNA 基因的表达图谱。在芯片的基础上，Nelson 等人发展出一种叫做 RAKE (RNA-primed，array-based Klenow enzyme assay) 的方法能够在特定的细胞和肿瘤中同时检测所有的 miRNA 的表达图谱。  


　　原位杂交技术用来检测 miRNA，更直观的展示出 miRNA 的表达方式，是了解 miRNA 的时空表达谱更方便的方法。Johnson 等人通过在 let-7 启动子后加 GFP 基因来跟踪检测线虫中 let-7 的时空表达。 Mansfield 等人根据 miRNA 的作用机制设计出一种带 Laz 报告基因的检测方法，被叫做“miRNA sensor”，能特异的从原位检测到 miRNA 的表达。