【求助】原核表达蛋白放置一段时间后有沉淀

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-12-09 22:34 作者: S6044 来源: 分析测试百科网

各位大虾好，我前段时间表达，并且用镍株纯化了一下，是His标签的，蛋白电泳与WESTERN都鉴定没有问题，测浓度为1.2mg/ml，分装放于-20，没有冻融过，前几天想用的，一拿出来化了之后有好多絮状沉淀，重新表达的放一段时间还是这样。我该怎么呢？

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【求助】原核表达蛋白放置一段时间后有沉淀

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langlang (2013-12-09 22:34:16)

蛋白在buffer里面不稳定，可能是由于疏水作用自发的聚集了，你可以试一下在ni柱纯化完之后把它透析到含100~200mM NaCl，1mM EDTA 50%甘油的stroage buffer中
S6044 (2013-12-09 22:34:57)

谢谢，好的，透析的时候怕损失太大，能不能用个什么溶液稀释一下呢，比如水或PBS？
ffaa (2013-12-09 22:37:27)

你的蛋白应该是变性了，由于蛋白浓度太大，没有保存在规范的冻存buffer中，-20放置是不稳定的。
我的纯化好的蛋白是经过在50mM TRIS-HCL 和50mM NaCL同时加20%甘油，4摄氏度透析后，分装在预冷的EP管中，保存在-80。透析损失掉25%，已经算不错了。但这样保存的蛋白活性很好，使用前离心基本没有什么沉淀，用一次拿一管，效果很好，活性稳定。与你蛋白变性比起来，肯定做个透析非常划得来。

对了，要慎用EDTA，并不是所有的蛋白都可以用EDTA保存。尤其是你的蛋白酶活性中心有金属阳离子的话，应该避免EDTA，因为EDTA可螯合金属离子，这对酶的失活作用是不可逆的。
雪花子 (2013-12-09 22:38:08)

你的蛋白应该是变性了，由于蛋白浓度太大，没有保存在规范的冻存buffer中，-20放置是不稳定的。
我的纯化好的蛋白是经过在50mM TRIS-HCL 和50mM NaCL同时加20%甘油，4摄氏度透析后，分装在预冷的EP管中，保存在-80。透析损失掉25%，已经算不错了。但这样保存的蛋白活性很好，使用前离心基本没有什么沉淀，用一次拿一管，效果很好，活性稳定。与你蛋白变性比起来，肯定做个透析非常划得来。

对了，要慎用EDTA，并不是所有的蛋白都可以用EDTA保存。尤其是你的蛋白酶活性中心有金属阳离子的话，应该避免EDTA，因为EDTA可螯合金属离子，这对酶的失活作用是不可逆的。

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如果是因为浓度高而沉淀就应该不是变性了，这种情况有时用高盐溶液或者直接透析到含50%甘油的storage buffer中沉淀会自动溶解。
ffaa (2013-12-09 22:38:43)

LS的哥们说的也对，比如BSA，用久了会有沉淀。但是常温多放一阵子沉淀就自动消失了。
S6044 (2013-12-09 22:39:06)

你的蛋白应该是变性了，由于蛋白浓度太大，没有保存在规范的冻存buffer中，-20放置是不稳定的。
我的纯化好的蛋白是经过在50mM TRIS-HCL 和50mM NaCL同时加20%甘油，4摄氏度透析后，分装在预冷的EP管中，保存在-80。透析损失掉25%，已经算不错了。但这样保存的蛋白活性很好，使用前离心基本没有什么沉淀，用一次拿一管，效果很好，活性稳定。与你蛋白变性比起来，肯定做个透析非常划得来。

对了，要慎用EDTA，并不是所有的蛋白都可以用EDTA保存。尤其是你的蛋白酶活性中心有金属阳离子的话，应该避免EDTA，因为EDTA可螯合金属离子，这对酶的失活作用是不可逆的。

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非常感谢，这样处理的蛋白能够用来包被酶标板做ELISA吗？
ffaa (2013-12-09 22:40:01)

QUOTE:
原帖由 S6044 于 2013-12-9 22:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
你的蛋白应该是变性了，由于蛋白浓度太大，没有保存在规范的冻存buffer中，-20放置是不稳定的。
我的纯化好的蛋白是经过在50mM TRIS-HCL 和50mM NaCL同时加20%甘油，4摄氏度透析后，分装在预冷的EP管中，保存在-80。透析损失掉25 ...
那你的蛋白37度时候，沉淀还在吗？
大白菜 (2013-12-09 22:40:19)

蛋白纯化后，一般不要全部冻到-20 ，保存溶液很重要，要先取个几百微升试几种保存溶液，一般保存缓冲液中不能没有盐，优化时可以加甘油，BSA ，确保实验稳定后再-20冻，要不所有的蛋白会前功尽弃的
S6044 (2013-12-09 22:41:14)

那你的蛋白37度时候，沉淀还在吗？

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在的，在室温下混一段时间后还是会有很多沉淀的。
ffaa (2013-12-09 22:42:15)

我把蛋白保存在甘油里一直没遇到这种问题，但我想你的蛋白是1mg多每ml，浓度蛮大，离心后会有损失，但是做Elisa应该不会出什么差错。但是沉淀用来包被是不可能了，重新离心一下，测一下蛋白浓度包板喽，下次纯化好就放甘油里再冻存啊。

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我要是你我会拿沉淀电泳看看。
S6044 (2013-12-09 22:42:40)

QUOTE:
原帖由 ffaa 于 2013-12-9 22:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我把蛋白保存在甘油里一直没遇到这种问题，但我想你的蛋白是1mg多每ml，浓度蛮大，离心后会有损失，但是做Elisa应该不会出什么差错。但是沉淀用来包被是不可能了，重新离心一下，测一下蛋白浓度包板喽，下次纯化好就放甘油里再冻存 ...
好的，我下次就试一下。是这个保存液吧？50mM TRIS-HCL 和50mM NaCL同时加20%甘油，4摄氏度透析后，分装在预冷的EP管中，保存在-80。
ffaa (2013-12-09 22:43:24)

QUOTE:
原帖由 S6044 于 2013-12-9 22:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

好的，我下次就试一下。是这个保存液吧？50mM TRIS-HCL 和50mM NaCL同时加20%甘油，4摄氏度透析后，分装在预冷的EP管中，保存在-80。

一般把甘油加到50%，我见好多公司产的蛋白保存液也是50%。所以也不是非常确定的，你根据实验决定。