【求助】帮忙解决western blot条带飘问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-12-10 10:24 作者: ending 来源: 分析测试百科网

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【求助】帮忙解决western blot条带飘问题

这是我最近做的western图片，是相当的飘逸，求高手帮忙解决。

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最新回复

ending (2013-12-10 10:26:48)

具体情况是，上面的大分子蛋白为120KD，下面的蛋白为60KD，一抗按照1：1000，二抗按照1:2000添加，转膜缓冲液为3.02g Tris, 14.4g Gly, 15%甲醇，定容至1L。快转100V恒压1h.我个人认为是转膜过程中出现了问题，但是具体什么问题则不清楚，跟战友们探讨一下哈。

77836941.jpg
ending (2013-12-10 10:28:26)

这与你电转没有任何关系，主要问题出在你蛋白电泳上。鉴于你左侧条带清晰无问题，右侧条带拖尾的原因有可能是此样品在最边侧的泳道上，或者此部分胶不均匀。如果是前者，在你的检测样品组泳道边侧再加一个无关样品，应该可以消除此现象。后者的话，重新倒块胶wb喽[/size

谢谢你的回帖，有几个问题我还想说明一下，我所有的泳道都不是空的（没有点蛋白样品的孔是用1*loading buffer填充的），也没有用两边的泳道。这样类似的飘逸的图我连着至少做了10张了，都飘，继续伤心啊。
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[ 本帖最后由 ending 于 2013-12-10 10:33 编辑 ]
avi317 (2013-12-10 10:29:37)

看楼主的图片，我觉得电转的问题不是很大，不知道楼主转膜结束有没有用丽春红染一下膜，当时的条带是什么样的，建议下次做WB最好丽春红染一下膜这样心里比较有底。我个人的观点认为电泳的问题比较大，我们做WB的时候分离胶尽量混匀，灌胶的时候要快不能有气泡等的，其实分离胶的配制好坏是WB的关键，还有就是上样的时候最好两边都不要上样品，上等量的1*SDS loading buffer，这样可以预防边缘效应，还有每个样品的浓度尽量调到一致，就是每孔的上样体积最好控制差不多，这样跑的条带比较好看。希望对楼主有帮助。
ending (2013-12-10 10:33:29)

QUOTE:
原帖由 avi317 于 2013-12-10 10:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

看楼主的图片，我觉得电转的问题不是很大，不知道楼主转膜结束有没有用丽春红染一下膜，当时的条带是什么样的，建议下次做WB最好丽春红染一下膜这样心里比较有底。我个人的观点认为电泳的问题比较大，我们做WB的时候分离胶尽 ...
谢谢回帖，我又附上了一张最近的WESTERN图。有几个情况说明一下。首先，我的电泳的蛋白是纯化过的，几乎就只有显示出来的这几条带，杂带很弱，不像细胞提取的天然蛋白那样有很多，所有用丽春红染转膜后的膜是什么都看不到的；其次，我没有上样的孔都是用1*loading buffer补齐的，每个孔只能保证上样体积一样，蛋白含量是不一样的。我现在也觉得可能是制胶的问题，可能是制胶的试剂吧，我再换着试试。
yjf1026 (2013-12-10 10:34:03)

QUOTE:
原帖由 ending 于 2013-12-10 10:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

这与你电转没有任何关系，主要问题出在你蛋白电泳上。鉴于你左侧条带清晰无问题，右侧条带拖尾的原因有可能是此样品在最边侧的泳道上，或者此部分胶不均匀。如果是前者，在你的检测样品组泳道边侧再加一个无关样品，应该可以 ...
应该是倒胶的问题。。。
moonlight45 (2013-12-10 10:35:12)

应该不是配胶和跑胶转膜的问题，因为下面的小分子蛋白条带正常，下图的大分子条带也有正常的，而且楼主所有条带“飘逸”的方向一致，感觉是曝光的时候发光底物加太多的原因，我们有些时候在加了发光底物后都用保鲜膜覆盖如果磨不平整或有气泡也可能这种情况。
3648755 (2013-12-10 10:35:32)

1、降低上样量可能条带会漂亮些

2、建议再试试膜再生

3、裂解时多加DTT
eric930 (2013-12-10 10:35:53)

我的小小建议是，你换新的loading buffer。
bananapeople (2013-12-10 10:36:31)

我觉得制胶和电泳都是需要仔细检查的环节。
建议楼主把电泳结束的胶染考马斯亮蓝看一下，如果没有问题再按楼上战友说的丽春红染膜吧。
49888 (2013-12-10 10:41:45)

可能漏胶了，导致条带的弥散，跑胶的时候，看一下浓缩胶样品是否漏了。胶可能也没凝好。
ending (2013-12-10 10:44:19)

应该是倒胶的问题。。。

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恩，我们倒胶的夹具有点松，在凝固之前容易漏胶倒是真的，我多加了些AP后效果好点了。
ending (2013-12-10 10:47:18)

应该不是配胶和跑胶转膜的问题，因为下面的小分子蛋白条带正常，下图的大分子条带也有正常的，而且楼主所有条带“飘逸”的方向一致，感觉是曝光的时候发光底物加太多的原因，我们有些时候在加了发光底物后都用保鲜膜覆盖如果磨不平整或有气泡也可能这种情况。

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发光底物我用的Millipore的，全膜AB液加起来一共用1ml,我觉得不算多了吧
ending (2013-12-10 10:49:29)

1、降低上样量可能条带会漂亮些

2、建议再试试膜再生

3、裂解时多加DTT

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我试了，降低上样量是个不错的主意。麻烦再问一下，膜再生是什么意思？有什么用呢？

另外，我的蛋白是分泌到胞外的，不用裂解获得蛋白，离心一下就行了。
ending (2013-12-10 10:49:46)

我的小小建议是，你换新的loading buffer。

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好的，我试试，不过要等些日子，我每次拿到纯化后的蛋白后就直接加上loading buffer混匀后储存在-20℃，每次电泳之前再煮5min，然后上样的。
kuaizige (2013-12-10 10:52:45)

转膜的问题，转膜时液体太多了
glass (2013-12-10 10:54:51)

好的，我试试，不过要等些日子，我每次拿到纯化后的蛋白后就直接加上loading buffer混匀后储存在-20℃，每次电泳之前再煮5min，然后上样的。

哦，我们每次都是收了蛋白，裂解好了加LOADING BUFFER 立马95度煮5MIN 然后要是不立马跑的话就直接放-20°或者4°，上样之前还会煮一下。

不过我觉得真有可能是loading buffer的问题，我同学之前也是这样，后来重新配了新的loading buffer就好了。。祝你好运。
am10 (2013-12-10 10:56:48)

不知道marker是否也如此？
ending (2013-12-10 10:59:45)

转膜的问题，转膜时液体太多了

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电转是水平进行的，就应该要盖过夹具吧，怎么算多呢？
ending (2013-12-10 11:00:21)

不知道marker是否也如此？

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第一幅图，最右边的lane就是上样的western maker，我用的maker在相应抗体的作用下是显色的。也飘
windy+++ (2013-12-10 11:00:42)

我觉得是转膜的问题，我用半干转经常遇到这样的问题，可能是电压电流分配不均匀导致的，楼主是湿转的，请尽量保证滤垫的厚薄一致以及夹的力量均一，希望能尽早解决