【求助】 western结果原因

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• gemei0115 (2013-12-10 15:13:46)

  
  我的一抗是多克隆的，用的1；800 二抗1；2000，怎么回事啊，急啊

• 831226 (2013-12-10 15:14:29)

  你的背景过深，非特异性条带多。
  首先，你用的是多克隆1抗，所以不可避免的会发生非特异条带多的结果，建议你调整并稀释1抗浓度。而且，如果block不好，也可以导致你这样的结果，建议你在看看你block条件如何，我一般用5% silk milk 在常温下封闭1小时。
  另外，你2抗的浓度也很高，不知道你2抗的效价和结合力怎么样，我一般用1:20000的2抗孵育。
  最后，还可以适当的调整曝光时间来得到最为理想的条带结果。如果30s曝光很深，可以试下10s或5s曝光。

• wmp1234 (2013-12-10 15:14:55)

  
  首先，我觉得楼主应该把你实验的关键细节列出来以便分析，比如封闭情况，一二抗浓度及孵育的时间和温度，曝光时间等
  现在没有，只好根据经验分析一下了
  补充楼上的：
  一抗二抗用5%BSA+TBST，减少非特异性结合，降低二抗浓度，二抗浓度和其生产公司很有关系，所以要根据说明书摸一下。在减少曝光时间的同时，可以用两张胶片叠在一起曝光，这样上面那张应该可以看。可以一抗4度过夜，二抗室温40分钟试试。
  
  如果做到以上这些还是背景深，那就看看你的抗体是否可以做你样品的种属，这个问题我发现还挺多人犯的，祝你实验早日成功

• gemei0115 (2013-12-10 15:18:05)

  谢谢大家的意见，我是5%BSA+TBST4室温封闭一小时，一抗5%BSA+TBST4度过夜，二抗室温一小时，另外我的蛋白是63KD，40V电转215分钟，最近又做了几次，总是这样，郁闷中

• fox_79 (2013-12-10 15:18:35)

  
  你降低一抗和二抗浓度试试看吧

• 2541 (2013-12-10 15:19:12)

  
  我以前遇到过这样类似的情况，还是一点，抗体不好！
  我提几点经验：
  我不建议你稀释一抗，因为你目的带已经很弱，尽管背景很深，稀释后背景和目的带都会按比例的减弱，甚至看不到目的带。你的目的带在63Kd 正好是细胞中高分度蛋白去，兔多抗识别的非特异蛋白 正好在这个区域。
  封闭是要考虑的，BSA封闭的效果没有牛奶好，建议改用5%-10%的脱脂牛奶封闭室温2小时，足够，再长也不会增加封闭效果的
  一抗4度过夜，二抗（1：7000左右）也在4度孵育2-8个小时左右，不要太久，低温是降低背景的非常有效地方法。而且配一抗的抗体的TBST可以适当提高NaCl浓度以及tween的浓度。
  延长洗膜时间，可以洗2小时，但是只要换四次洗膜液就可以了。可以适当提高tween的浓度。
  如果再不行，可以用温和的裂解液裂解细胞，然后用兔的IgG预处理你要的细胞裂解液，家protein A 柱子后，离心，收集上清液，然后用你的抗体跑western，理论上会降低杂带的。原理是用兔的IgG将裂解液中的杂带蛋白沉淀出来，然后在用你的兔多抗做WB，那么杂带蛋白就会少很多了。

• 3648755 (2013-12-10 15:24:02)

  
  我也有这个问题，也试了很多一抗、二抗浓度，但浓度大了就这样，浓度降低了就变空板了，什么也出不来，困扰！

• yjf1026 (2013-12-10 15:25:20)

  我也是的啊，刚换了二抗1：4000就给我个空板看，郁闷极了

• 49888 (2013-12-10 15:27:32)

  
  其实做WB实验应该设计好多参照的，这样可以便于分析实验出现的状况：
  
  1。你提到换二抗就是空板，可以同时做个内参一抗，看看本次细胞裂解转膜没有问题，蛋白确实在膜上。
  
  2。如果内参很清晰但是目的蛋白没有或者背景还是很高的话，应该是你选的一抗有问题，建议换一抗。
  
  3。可以通过膜封闭，洗涤降低二抗来去除背景

• 8princess8 (2013-12-10 15:28:15)

  
  我觉得可以试试这种方法，一抗，二抗孵育之后用0.1%TBST多洗几次，比如4分钟，5次应该可以避免，还有就是增大二抗稀释倍数也可以避免！

• gemei0115 (2013-12-10 15:29:29)

  
  最近几次都没出条带，很干净，今天用丽春红染膜后有条带（也有些非特异性条带），然后曝光就什么都没有怎么回事啊？

• gemei0115 (2013-12-10 15:32:04)

  我查了一下，我的抗体应该没有加错，是不是一抗二抗浓度低了，或者是发光剂加少了，我发光剂A液和B液共用了300微升，那除此之外还可能是为什么啊？？

• qqq111 (2013-12-10 15:39:47)

  我查了一下，我的抗体应该没有加错，是不是一抗二抗浓度低了，或者是发光剂加少了，我发光剂A液和B液共用了300微升，那除此之外还可能是为什么啊？？
  
  发光液总体积应该800微升左右，你也太节约了，除非你的NC膜只有1平方厘米，

• taoshengyijiu (2013-12-10 15:47:06)

  我查了一下，我的抗体应该没有加错，是不是一抗二抗浓度低了，或者是发光剂加少了，我发光剂A液和B液共用了300微升，那除此之外还可能是为什么啊？？
  
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  发光液总体积应该800微升左右，你也太节约了，除非你的NC膜只有1平方厘米

• taoshengyijiu (2013-12-10 15:49:01)

  最近几次都没出条带，很干净，今天用丽春红染膜后有条带（也有些非特异性条带），然后曝光就什么都没有怎么回事啊？
  
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  估计是抗体的问题吧！提高浓度试试吧！我现在勉强能曝光出条带！很弱！可能和我一抗使用时间太长有关，效价降低了！

• gemei0115 (2013-12-10 15:50:17)

  
  是啊，我提高了一抗到1:400 二抗到1:800，结果是有了，但是条带很浅，而且杂带还是很多，无奈，到底像这种情况应该怎么做啊？我的蛋白上样量是50微克，应该也还凑合吧。

• tangxin_80 (2013-12-10 15:57:12)

  
  这个是全泳道？你是否剪了膜？如果二抗稀释后还是这样的结果，换个二抗，并不一定是一抗的问题。

• gemei0115 (2013-12-10 16:00:41)

  不是全泳道，我是切了胶后转的呀，是膜压的片，有点时候觉得一抗稀释液也似乎很重要呢，因为一次换了好的BSA来稀释一抗，会出点结果，虽然结果也不是很好

• wmp1234 (2013-12-10 16:03:25)

  
  对于WB，一抗二抗都很重要，其实就跟找对象一样，要对得上眼。当然大多是一抗的问题，但你的这种情况，WB能看到主带，而且是特异的，其余的是地方并没有带出现，而是弥散的背景，用10%的脱脂奶粉（通常用的是5%）封闭是可以降低这种背景的，同时上二抗之前你也可以封闭半小时，这些都可以降低背景。当然你可以换个二抗试试，jackson的二抗都可以1:10000-100000用。

• kuaizige (2013-12-10 16:07:48)

  用5%BSA+TBST封闭，4度过夜试试。一抗、二抗都是可以室温孵育的1-2h就可以。多洗几次，如5min×5次或10min×5次。从你的图片上看，一抗如果是国产的1：400好像可以、二抗如果是进口的，稀释度可以增大些。