在细胞中直接测量蛋白磷酸化的简便方法

磷酸化和去磷酸化是细胞中酶的化学修饰调节中最常见，也是最重要的。很多酶需要磷酸化后才有活性，然后再进一步使它的下游磷酸化。Cisbio Bioassays 提供一系列HTRF磷酸化蛋白测量试剂，可以直接检测细胞裂解液或完整细胞中的磷酸化蛋白的含量。该方法操作简单、稳定可靠、灵敏度高，并且可以用很小体积的微孔板进行实验，非常适合高通量筛选。生物通 www.ebiotrade.com
检测原理
实验可在细胞裂解液或者完整细胞中进行。当受体被刺激后，引发了相关激酶的活化，导致下游蛋白被磷酸化。细胞膜裂解之后，磷酸化的蛋白释放出来，被HTRF试剂检测到。磷酸化蛋白的测量应用了双抗体夹心法，两个抗体均为单克隆抗体。其中一个为抗磷酸化蛋白的抗体，标记Eu；另一个为抗蛋白其它位点的抗体，标记d2，见图1。这些抗体可以预先混合后，通过一次加样来完成。所有的实验均可通过两步法或者一步法实现。生物通 www.ebiotrade.com

图1：HTRF磷酸化蛋白测量的实验过程生物通 www.ebiotrade.com
一步法：
细胞铺板，化合物刺激，细胞裂解和磷酸化蛋白检测均在同一个板孔中，不需要洗涤过程（图2a）。此方法更加适用于高通量筛选，并且在不影响HTRF优越性的前提下减少了试剂用量。生物通 www.ebiotrade.com
两步法：
细胞置于培养板中，化合物刺激后裂解细胞。将裂解液转移到检测板中，加入HTRF检测试剂检测磷酸化蛋白（图2b）。该方法可以观察细胞的存活和生长情况。生物通 www.ebiotrade.com

特点和优势生物通 www.ebiotrade.com
应用HTRF技术，稳定、灵敏、可靠
基于一抗的直接检测方法 生物通 www.ebiotrade.com
直接检测细胞裂解液，操作简单快速，可替代Western Blot和ELISA
可用于细胞水平的高通量筛选，并且相比其它技术拥有更高的Z’值 生物通 www.ebiotrade.com
适用于多种类型的细胞，包括原代细胞
适用于过表达和内源性受体