RNA干扰的抗病毒效应

1   RNAi的发现

RNAi现象最初是在转基因植物中发现的. 10 a前，在对牵牛花(Petunias)进行研究时发现，将色素合成基因置于一个强启动子后，导入牵牛花中，试图加深花朵的紫颜色，结果是不仅转入的基因未表达，而且自身色素合成也减弱了. 当时将这种现象称为转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)或“共抑制”(co-suppression)，并认为这是少数几种植物中的特殊现象，因为当人们将外源基因转入受体后，总是希望外源基因能高效表达，然而事与愿违的是，转基因导致的基因沉默广泛存在于植物、真菌、动物中. 这表明，转基因沉默并非偶然现象，而是普遍存在的一种基因调控机制.

        几年后，有学者用反义RNA阻遏华丽新小杆线虫(caenorhabditis elegans) par-1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA确能阻断par-1基因的表达，但奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，同样也阻断了该基因的表达[1]. 接着，Fire及其同事首次将正义链和负义链的双链RNA(dsRNA)注入线虫，结果表现出比单独注射正义链或负义链都强得多的基因沉默. 实际上每个细胞只需少数几个dsRNA分子就能完全阻断同源基因的表达. 注入双链RNA不仅可以高效阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其下一代同源基因的沉默，Fire将这种现象称为RNAi[2]. RNAi代表了一种古老的PTGS通路，目前，RNAi 现象已经在很多生物体中被发现[3, 4]，比如植物、真菌、果蝇及包括小鼠在内的脊椎动物. 针对基因功能研究中的敲除技术，科学家将RNAi称为对靶基因的“knockdown”，这是一个在后基因组研究中可与“knockout”相媲美的技术. 2001年，RNAi技术被成功地引入到哺乳动物细胞基因功能的研究中，使其应用前景更为诱人[5, 6].


2   RNAi的作用机制自从RNAi现象被发现后，其机制的研究就成为一个热点.在对线虫、果蝇进行大量研究后，产生了现有RNAi作用机制模型，该模型包括起始阶段和效应阶段[ 7-9]. 在起始阶段，导入的dsRNA被切割成21-23 nts的小分子干扰RNA(small interfering RNA， siRNA). 有证据表明，一个被称为Dicer的核酸内切酶能以ATP依赖的方式逐步切割由外源导入的双链RNA，将其降解为19-21nts的小片段，该片段具有5’-磷酸，3’-羟基和1-2个核苷酸的3’-粘性未端. Dicer 是Rnase Ш家族成员之一，在进化上相对保守，包括2个活性区域、1个RNA解旋酶活性区域及一个PAZ活性区域. 研究发现，重组人Dicer(re-hDicer)能体外切割dsRNA而生成有活性的siRNA，这表明Dicer参与了RNAi过程[10, 11 ]. 对大多数哺乳动物来说，长片段的dsRNA的引入可激活RNA依赖的蛋白激酶(RNA-dependant protein kinase， PKR)和2’，5’寡腺苷酸合成酶，而引起非特异性反应.PKR可通过一系列磷酸化使得翻译起始因子eIF-2α(initiation factor-2α)失活而导致RNA大范围、非特异性的翻译阻遏，而2’，5’寡腺苷酸合成酶可活化RNase L，进而非特异性降解RNA[12]. 随着研究的深入，人们逐渐认识到，在基因沉默发生过程中，大约21nts大小的siRNA直接起“干扰作用”，引入小片段的siRNA不仅能特异性的抑制同源基因的表达，而且也不会导致由PKR引起的非特异性反应[13-17]，这无疑会加快哺乳动物基因功能的研究，为疾病的基因治疗带来新的希望.

        在RNAi效应阶段，被Dicer加工成的siRNA与解旋酶、核酸酶等一起组成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC). 此外，亦有文献[18]报道，来源细胞核的发夹(hairpin)RNA亦可经细胞内酶的作用后产生内源性siRNA，进而在胞质内形成RISC.RISC激活时需要解旋酶以ATP依赖方式将siRNA解开，激活的RISC通过碱基配对将反义链定位到同源的mRNA转录本上，引导核酸酶在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA. 研究表明，被切割的mRNA不产生任何中间产物，这提示RISC复合物中可能还含有核酸外切酶[19].

         RNA干扰至少具有以下几个重要特征: (1)高专一性.与靶mRNA之间一个碱基错配都会明显削弱基因沉默的效果. 不过并非所有符合条件的siRNA都同样有效，具体原因还不清楚，可能是位置效应(postitional effects)所致[20]. (2)高效性.实验表明，极少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，达到缺失突变体表型的程度，而仅凭几个dsRNA被Dicer切割成数十个siRNA并不能作出令人信服的解释，为此，有人提出随机降解PCR (random degradative PCR)模型.认为一种称之为RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，PdRP)以siRNA为引物扩增模板mRNA，产生的dsRNA供给Dicer，结果产生更多的siRNA[9, 21]. (3)传递性. RNAi具有很强的细胞穿透力，可以在不同细胞间传递和维持，甚至可以传至子代.

3   RNAi抗病毒效应的研究进展转录后基因沉默作为植物细胞抗病毒的机制早已得到确认[22-27]，随着对RNAi现象的深入研究，人们发现动物细胞同样存在RNA干扰介导的抗病毒效应[28, 29].RNAi并被认为是机体阻止病毒复制、保护细胞免受病毒入侵的一种古老防御机制.动物细胞基因组中含有大量的病毒和转座子DNA，如何识别并抑制这些“非己”分子是机体面临的确重大挑战. 通常，导入的DNA由于甲基化而失活. 近年来研究表明，细胞为保护自身基因免受损害，如病毒入侵或转座子插入而采取基因沉默这一调节机制，目的是使入侵的外源基因失活，而不影响自身基因的表达，因此有学者称RNA干扰为基因组的“免疫系统”[9, 30]. 近年来，已有多个研究小组在植物病毒和动物病毒中发现并分离出能特异性抑制RNA干扰的某些抑制因子[28, 31-35]，这一发现有力说明了RNAi是机体自然的抗病毒防御机制，对RNAi的抑制是病毒对宿主细胞抗病毒感染的一种适应. 尽管RNA干扰抗病毒的精确机制尚不清楚，研究表明，在小鼠和人的细胞中，直接转入siRNA，产生了具有序列特异性的抗病毒效应，其过程并不激活PKR及RNase L酶.

        HIV-1是一种RNA逆转录病毒，其生活周期特殊而复杂.病毒包膜糖蛋白gp120与宿主细胞膜上的CD4抗原作用，引起gp120构象改变，使之适合与协同受体结合，gp120-gp41复合物构象的进一步改变导致gp41介导的病毒与细胞膜间的融合，病毒衣壳分解，RNA进入细胞质内. 随后，RNA被逆转录为cDNA，在整合酶的作用下，cDNA整合至宿主细胞DNA上，形成前病毒. 当病毒获得活化信号时，其DNA转录RNA，经过修饰与翻译，成熟的子代被装配和释放出来. HIV-1生活周期早期阶段和晚期阶段，均可成为siRNA作用的靶点. siRNA一旦进入细胞，其作用就如同药物，能特异性地阻止病毒继续感染. 新近几个研究小组将不同siRNA小片段体外引入细胞中，发现与siRNA同源的靶基因不同程度地被降解，同时，HIV的复制受到抑制，表现出HIV-1 p24的产量显著下降. 除HIV-1本身的结构与调节基因外，与病毒复制有关的宿主细胞受体分子如CD4，CCR5亦可成为RNAi的靶点