【求助】高浓度咪唑洗脱不掉目的蛋白，能否说明蛋白...

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• am10 (2013-12-12 15:29:59)

  我很少看到有人说在亲和柱上蛋白会变性，所以过来凑个热闹，等高手来解答。
  不过我觉得你300mM咪唑应该都把你目的蛋白洗脱下来了，我用咪唑都是150mM，你要考虑你加到很高浓度咪唑的时候咪唑本生会有一个很高的咪唑峰，你是否SDS-PAGE 鉴定过高咪唑的时候也有你的目的蛋白呢？还有你怎么确定柱子上还有很多目的蛋白的？

• cocacola (2013-12-12 15:33:36)

  QUOTE:

  原帖由 am10 于 2013-12-12 15:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我很少看到有人说在亲和柱上蛋白会变性，所以过来凑个热闹，等高手来解答。
  不过我觉得你300mM咪唑应该都把你目的蛋白洗脱下来了，我用咪唑都是150mM，你要考虑你加到很高浓度咪唑的时候咪唑本生会有一个很高的咪唑峰，你是否S ...

  我都是用sds-page检测的，把最后洗脱过的柱子煮了10min上样后检测的

• am10 (2013-12-12 15:34:48)

  QUOTE:

  原帖由 cocacola 于 2013-12-12 15:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  我都是用sds-page检测的，把最后洗脱过的柱子煮了10min上样后检测的

  那你是在尿素里面变性过的NI吗？如果在可溶表达加咪唑超声可能会有效果。

• am10 (2013-12-12 15:35:41)

  
  那你是在尿素里面变性过的NI吗？如果在可溶表达加咪唑超声可能会有效果。
  

• cocacola (2013-12-12 15:36:57)

  我没变性，蛋白是可溶性表达，破菌是用高压破菌的。是不是细胞裂解液存放久了？我是在-80存放细胞裂解液的。
  上柱前我已经高速离心掉了少许沉淀

• H2O (2013-12-12 15:37:20)

  
  不知道楼主的实验细节是如何的，比如pH值等。
  目的蛋白可有挂上柱子，可有检测过穿过样品呢？
  一般来说500mM Imidazole 足够的了，若怀疑其在柱子发生了沉淀，可以在洗脱后再用8M Urea
  或6M Gu*HCl再wash一下 column，收集，各部分取样进行SDS-PAGE。
  
  同时，电泳时应有一道离心后的上柱前样品，检测其表达的情况。

• DONT (2013-12-12 15:38:35)

  
  走柱的时候压力有上升吗？一般蛋白大量沉淀在柱子上的话压力会上升的。沉淀可能是样品buffer和平衡buffer不一致造成的。如果压力没有变化，考虑是不是蛋白和柱子有非特异的吸附，回收一下柱子看会不会有改善。

• fox_79 (2013-12-12 15:38:56)

  你首先取一些柱子，跑一下电泳，看看是不是柱子上面有蛋白沉淀上，如果有，然后，使用变性剂或者耦合剂将蛋白洗脱下来，然后，再透析。

• gogo (2013-12-12 15:39:27)

  小弟目前用his纯化一批蛋白，但是洗脱的时候出现点问题，我用300mM咪唑浓度的洗脱液，同时还用450、500、800mM浓度洗脱，在300mM的时候就洗脱了很多，后面的几种浓度洗脱的很少，最终的柱子上仍然有很多目的蛋白没有 被洗下来，我感觉再增加浓度也不会有多大 效果的。看了论坛上的帖子，我在想洗不下来蛋白是不是在柱子上变性沉淀了？
  其实之前柱子上有少许沉淀的，我觉得影响不大，不知道这样洗脱下来的蛋白是不是已经变性了
  
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  个人觉得这个和蛋白本身有关，有的蛋白就容易变性沉淀，在高浓度的情况下；
  不知你binding buffer及elution buffer里盐的浓度是多少，可以适当提高一点，降低蛋白之间的分子键；
  祝好运！