【求助】关于150KD，跨膜蛋白的提取及western

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-12-12 15:59 作者: 雪原来源: 分析测试百科网

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【求助】关于150KD，跨膜蛋白的提取及western

这个问题已经困扰我几个月了，几个月前，我做细胞中150KD的跨膜通道蛋白，提取及western检测，都还挺顺利，但后来发现，用0.1%NP40进行裂解后，有大块的离心后不易贴壁的团块，western检测信号不好，之后改成碧云天的RIPA（强），裂解后溶液非常粘稠，离心后有小块很黏的东西，不易贴壁，但检测后信号仍然不好，几乎没有，不知道什么原因，抗体没问题：做免疫荧光很好。

有人说上样缓冲液中还原剂不够，可能导致通道蛋白形成聚合体，但我改进后，仍然没效果。
希望高手们能提宝贵建议，谢谢啦！

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yonger (2013-12-12 16:00:17)

QUOTE:
原帖由雪原于 2013-12-12 15:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

这个问题已经困扰我几个月了，几个月前，我做细胞中150KD的跨膜通道蛋白，提取及western检测，都还挺顺利，但后来发现，用0.1%NP40进行裂解后，有大块的离心后不易贴壁的团块，western检测信号不好，之后改成碧云天的RIPA（强），裂解后溶液 ...
什么组织？
雪原 (2013-12-12 16:00:48)

补充：蛋白在泳道两侧拖尾，有时在正确的位置会出现蚯蚓状条带，但还是拖尾。裂解时候会有团块，粘稠，12000rpm，10分钟离心，不易贴壁，取上清99度煮5分钟，会有絮状沉淀，摇一摇就会溶解。但样品4度静置一天后，会出现沉淀。不知道点样时是否要将沉淀一起点入？？

转膜：PVDF膜，350mA，100分钟。
雪原 (2013-12-12 16:01:12)

QUOTE:
原帖由 yonger 于 2013-12-12 16:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

什么组织？
不是组织，外源转染的293细胞，因为质粒带有GFP，可以保证转染效率
yonger (2013-12-12 16:02:30)

你用什么裂解液？
293细胞蛋白还不好提取啊。。。
yonger (2013-12-12 16:03:01)

计数多少细胞加多少裂解液？
雪原 (2013-12-12 16:03:20)

以前用0.1%NP40,现在用碧云天的RIPA（强）。没有计数，只是按照培养皿的大小加裂解液，6cm的培养皿加200-300ul，10cm的培养皿加800-1000ul。谢谢。
yonger (2013-12-12 16:03:47)

裂解液量不算多
看短信息
wmp1234 (2013-12-12 16:04:22)

lz问题解决了没，我也渴求在293中提膜蛋白的方法