反义基因治疗技术研究进展

反义脱氧寡核苷酸（Antisense oligodeoxynuclecotide, ASODN）是一段与mRNA或DNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子。ASODN能通过封闭或抑制肿瘤细胞和病毒的关键编码基因来特异性抑制肿瘤细胞增殖和病毒的复制，是治疗肿瘤和病毒性传染病的潜在新型药物。目前在动物体内评价的反义药物有10余种，其中抗肿瘤作用的有7种，抗病毒作用的1种，其他如作用于心血管、代谢、免疫及细胞粘附系统的有4种。

    一、反基因药物作用机理的研究

    1.三螺旋DNA药物及作用机现。1957年Davies等首次根据试验结果提出三螺旋核酸的概念。70年代初期，Arrnott等根据X射线衍射结果，建立了三螺旋核酸分子的简单模型。与双螺旋DNA不同，三螺旋DNA的组成结构单元是三碱基体，它有两种基本类型：一种是嘧啶-嘌呤-嘧啶型三碱基体，如AT和G+·GC；另一种则是嘌呤-嘌呤-嘧啶三碱基体，如G·GC和A·AT等。这些三碱基体的形成具有专一性，具体体现在T（A）和G+（C）分别要与Watson-Crick碱基对通过Hoogsteen氢键结合。Gowers等通过实验证实了DNA三螺旋在含有很多嘧啶间隔的靶位点能形成并通过胞嘧啶的质子化进行稳定的三螺旋结构。根据三螺旋结构具有这种功能，科学地研制出了一种对核酸酶的稳定性和膜透性都有提高的新型DNA模拟物肽核酸（peptide nucleic acid. PNA）。它是一种以2-氨基乙基甘氨酸为基本单元的多肽核酸，可以通过一个甲基羰基把碱基与类肽链骨架相连，它与DNA及RNA之间除了Watson-Crick配对外，还可以通过Hoogsteen配对形成PNA-DNA（RNA）-PNA的三链结构，PNA与互补的DNA或RNA结合具有高度专一性，具备与靶基因形成二聚体的能力。

    三螺旋DNA结构形成的特异性和选择性为开发高效安全的肿瘤反义基因药物提供了理论依据。1988年Coocy实验的成功标志着肿瘤基因治疗新技术的诞生。

    2.反义基因寡脱氧核糖核苷酸药物及作用机理。ASODN的作用机是在DNA结合蛋白（如甲基化酶、激活子、限制性内切酶等）的识别位点处，通过与靶基因结合形成三螺旋，并且位点专一性地干扰DNA和蛋白的结合、激活子的转录起始或转录延伸等，进而阻止基因转录和复制。另外，通过ASODN进行化学改性，如在ASODN的3′-末端连接上化学切割试剂、乙二胺四乙酸、二价铁离子或邻菲罗琳的衍生物，在改性过程中需要铜离子和还原剂的存在，可实现对靶基因进行诱导切割等不可逆的反应，从而导致靶基因的失活。

    科学工作者通过以上原理已设想以下三种途径来治疗和控制肿瘤，（1）ASODN与靶DNA双螺旋形成三链状结构，从而导致肿瘤基因失活；（2）ASODN的化学改性作用，克服了细胞内限制性内切酶对未改性ASODN的快速水解作用，延长了ASODN在细胞内的半衰期；（3）ASODN的3′末端和5′末端可以采用许多封端基因来改性。

    3.反义基因的抗病毒作用。流感病毒一直威胁人和动物的健康，主要因为它变异快，从而导致疫苗的保护性小或无保护性，为此科学家们正在积极研究一种针对病毒的PB1（是流感病毒在复制和转录中具有重要作用的多聚酶复合体的组成部分，具有高度的保守性，且在流感病毒各型中具有同源性）的ASODN，即可导致病毒的复制受到抑制，从而达到抗病毒的作用。

    二、反义基因药物输送系统

    细胞对天然ASODN的摄取往往效率很低，其原因一方面是ASODN通过胞饮作用进入细胞内，主要分布于细胞器中，如溶酶体、高尔基体和内质网中，但ASODN真正的作用位点在胞浆和胞核内，所以起不到真正的作用；另一方面ASODN易受到核酸等物质的分解，而造成稳定性差。

    1.以聚合物微球为载体输送系统。可降解的聚合体为核苷酸药物提供保护并依赖其本身的结构特性控制所包裹药物的释放，还可以将其制成局部给药的植入系统或肠道外给药系统。研究最为广泛的聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羟乙酸（LA-GA），它是以丙交酯和乙交酯为单体形成的共聚物，两种单体的比例、聚合物的结晶度不同，降解属于水解反应，降解时间取决于两种单体的配比和聚合物的分子量，降解产物均为人体正常代谢物，构成的结合复合体具有潜在的转运反义核苷酸和核酶的作用。最新研究报道，用聚合体转运的反义核苷酸比游离的反义核苷酸的生物学效应更强。

    2.树枝状高聚物。树枝状高聚物（dendrimers，DEN）是一种新的超分子转运系统。可以转运带负电荷的ASODN，并形成稳定的复合物。这些复合物可提高细胞对ASODN的摄取及细胞内的利用率，同时促进ASODN向细胞核转运。

    3.脂质体、脂质复合物和两性阳离子。脂质体是由磷脂双脂质层包裹液体成分构成的，是一种常用的给药方式。以脂质体为口服药物的优点在于，反义基因药物包裹在脂质双层中，可以免受胃肠道中的酸和酶的破坏。另外，脂质体在结构上与细胞膜相似，具有一定的靶向性，可增加药物的吸收。阳离子脂质体和ASODN形成阳离子脂质复合物与带有负电荷的细胞膜亲和，通过胞饮进入细胞内。目前，脂体转移系统主要有两种，一种是疏水性胆酸与精胺共价结合，通过精胺或亚精胺与核苷酸结合构建的转运分子。

    4.受体介导。受体介导的胞饮作用可提高ASODN和核酶对特异组织和细胞的靶向作用，肿瘤细胞因对营养物质要求较高而对这种转运系统更为敏感。将核酶与转铁蛋白受体抗体（TEA）结合，可使其细胞摄取效率提高3倍。

    三、结语

    反义基因治疗技术在肿瘤治疗和病毒控制中显示出了诱人的应用前景，但ASODN自身的稳定性、给药途径及与非靶DNA或mRNA杂交而出现对机体毒副作用等问题尚未最终解决，故其研究尚处于试验阶段。