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【求助】膜蛋白的提取
【求助】膜蛋白的提取
做大鼠背根神经节 和脊髓中内质网上的膜蛋白 IRE1、 P-IRE1 。首先 不知道裂解液咋选？？操作流程及注意事项？ 文献没有写的很详细。其次 这两个蛋白的具体分子量我还不是很明确 除了文献能查到 没其他途径吗？再者 内参怎么选？ 新手 还请赐教 谢谢~~！
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【求助】膜蛋白的提取
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-12-13 16:43 作者: dongdongqiang 来源: 分析测试百科网
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flower-201 (2013-12-13 16:44:29)
IRE1 alpha
CSTh:ttp://www.cellsignal.com/products/3294.html
Abcam：cuturl('http://www.abcam.com/IRE1-antibody-ab37073.html')
p-IRE1
Abcam：cuturl('http://www.abcam.com/IRE1-phospho-S724-antibody-ab48187.html')
等等
做WB可以用总蛋白抽提试剂
蛋白提取中需要加蛋白酶、磷酸酶抑制剂及PMSF
内参可以选择beta-actin，beta-tubulin，GAPDH
H2O (2013-12-13 16:45:02)
如fang楼上所言，总蛋白可以用，但是不容易出来条带。
如不出，可以试试膜蛋白，配方和步骤如下：
Tris-HCl (5 mM), EDTA (2 mM) (pH 7.4),
即用去离子水配制 Tris-HCl , EDTA 到所需浓度并用PH记调到=pH 7.4
室温保存半年。临用前加蛋白酶抑制剂。
步骤：
1、用以上配制裂解液匀浆组织。
2、4度离心机2500rpm离心10-15min，吸取上部澄清液体（放入超速离心机专用离心管），弃掉下部沉淀。
3、 45000g离心30min，弃掉上清。
4、ripa裂解液+蛋白酶抑制剂溶解沉淀，分装保存。
至于内参，膜蛋白也可以用GAPDH.
flower-201 (2013-12-13 17:02:14)
QUOTE:
这个配方可以提出膜蛋白吗？提取膜蛋白的有效成分是啥呢？
学习下
ritou1985 (2013-12-13 17:03:07)
QUOTE:
进来学习一下..
您的第二步2500转的目的是啥? 如果是将核蛋白和线粒体沉下去,转速不对啊.
您的第三步,4万5千转是否不足?
qianqin1977 (2013-12-13 17:03:35)
您的第二步2500转的目的是啥? 如果是将核蛋白和线粒体沉下去,转速不对啊.
您的第三步,4万5千转是否不足?
你有什么想法？？说说 。
难道我做的这个蛋白不是直接用膜蛋白裂解液提取就行了吗？？楼上说的离心那么多次何意？？求解~~！！
qianqin1977 (2013-12-13 17:04:11)
难道我做的这个蛋白不是直接用膜蛋白裂解液提取就行了吗？？楼上说的离心那么多次何意？？求解~~！！
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你说的是提取整个蛋白(所有的蛋白)
我和前面几个人说的是,单独提出膜蛋白,这样能相对提高膜蛋白的量
junhun (2013-12-13 17:04:41)
那你怎么提取的膜蛋白？
【求助】膜蛋白的提取