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【求助】请各位高手看一下我的双向图

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-12-13 22:57 作者: ztonyc 来源: 分析测试百科网

刚刚开始做双向，该图是我的第一次，不是很好。把参数跟大家说一下！

样本：动物组织

提取液：7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，2％IPGbuffer，65mM DTT

蛋白提取：液氮研磨组织，按300mg／ml加入裂解液，超声，室温孵育1h（其间振荡混匀）

胶条及上样量：胶条为24cm pH3－10NL，上样量为2mg。

选用考马斯亮蓝R-250染色。

第一次做双向，想优化一下条件，但是又不知道该优化那些方面，请大家提出宝贵建议！谢谢啦～～

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【求助】请各位高手看一下我的双向图

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最新回复

eric930 (2013-12-13 22:57:58)

上样量为2mg？你定量是不是有问题
12xunmei (2013-12-13 22:58:22)

QUOTE:
原帖由 eric930 于 2013-12-13 22:57 发表

上样量为2mg？你定量是不是有问题
采用考马斯亮蓝 G250法定量，应该会有一定的误差，我也感觉蛋白量有点低。
BUK (2013-12-13 22:58:40)

你的胶凝得不好。蛋白质定量不准。
ztonyc (2013-12-13 22:59:06)

QUOTE:
原帖由 BUK 于 2013-12-13 22:58 发表

你的胶凝得不好。蛋白质定量不准。
胶凝了至少六个小时，这么长时间还没有凝好？

我觉得问题可能出在第一向，感觉大分子蛋白没有聚好，会不会是聚焦时间有点少。

我的聚焦参数：
200v step 2h
500v grad 2h
1000v grad 2h
8000v grad 3h
8000v step 55000vhs
总聚焦时间为71100vhs
c86v (2013-12-13 22:59:24)

1.个人感觉这个结果其实还可以，一向胶碱性端条纹是正常的。可以在样品中加点核酸酶(Benzonase)试试，除点核酸。要是觉得还不太理想，可以透析处理一下
2.至于上样量，感觉没有楼主所说的3mg，但平时一般是用G-250或者银染，没用R250染过，所以也不敢妄下结论
3.如果条件允许，楼主可以把样品分成两部份分析，一份用4-7的胶条，另一份用6-11的胶条
ztonyc (2013-12-13 22:59:50)

QUOTE:
原帖由 c86v 于 2013-12-13 22:59 发表

1.个人感觉这个结果其实还可以，一向胶碱性端条纹是正常的。可以在样品中加点核酸酶(Benzonase)试试，除点核酸。要是觉得还不太理想，可以透析处理一下
2.至于上样量，感觉没有楼主所说的3mg，但平时一般是用G-250或者银染，没 ...
谢谢您的指点，想再请教一个问题：您说的透析处理可以去除什么杂质？是盐吗？

我今天又跑了两根胶条，是3-10NL和3-10。我把聚焦伏小时数加大了。想确认一下聚焦时间的影响，以及蛋白在不同pH区域内的分布情况。

我的计划是先把双向的参数确定一下，然后在优化蛋白提取方法。您看这样合适吗？
BUK (2013-12-13 23:00:09)

从楼主贴出的结果看，参数可以不要做太大的调动，如果觉得横条纹较多，可以试着把聚焦电压调高一点，比如从8000提升到100000或者9000，总伏小时数可以维持不变，防止过度聚焦。
如果样品充足，可尝试除盐（丙酮沉淀，透析，超滤等），但哪种方法除盐效果好就要看具体的实验情况了；样品有限的话，个人觉得就现在这种处理方法也过得去。
实验室是做出来的，有条件的话可以多摸索一下~
祝楼主实验顺利
ztonyc (2013-12-13 23:00:29)

现在把聚焦时间延长了，电压也升高了。等图出来我会上传的，再一次谢谢你的指点