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【求助】western 目的条带未出现,marker却出来了
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我显影后发现胶片上出现了marker的条带,但是目的条带没有出来,整个胶片很干净,除了隐约有mark的条带什么都没有,不知为何?难道一抗都结合到maker上去了?
压片时间:2小时
我的一抗是兔来源的多克隆抗体,cst的买了不到一个月;
二抗是羊抗兔,Santa Cruz的;
marker 是MBI的Prestained Protein Ladder,希望高人给予解答!
另外,我的目的蛋白是膜蛋白,我是用RIPA提的总蛋白。转膜后marker条带很清晰。丽春红染色可以看到杂蛋白条带。内参用的是GAPDH,显影有条带。
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最新回复
bling (2013-12-13 23:01:57)
个人意见仅供参考
shanzhapia696 (2013-12-13 23:02:19)
首先,如果这个WB你之前没做过,是第一次做,那么你的问题出现在转膜上,或者一抗上。
根本就没转上膜,或者根本就转穿了。建议调整转膜时间,并用丽春红预染。
一抗失效或浓度偏低。建议调整一抗。
如果你之前做过,只是这次没做出来,那么建议你,检查条件跟以前是否一致。
这种情况,我可以基本断定问题出现在转膜步骤,而不是一抗二抗。因为大家都知道一抗二抗重要,都比较重视。恰恰忽略了,电泳和转印却是前提。。。
lixi559 (2013-12-13 23:02:36)
ii077345 (2013-12-13 23:03:01)
QUOTE:
可是我用丽春红染色可以看到蛋白条带,并且内参是可以做出来的。marker是预染的,在膜上很清晰。转膜我是40V for 3hours,难道转膜时间长了?我的目的蛋白是50kD 和 80KD的。我是第一次做western,有没有可能是NC膜时间长了失效了?阿司匹林 (2013-12-13 23:03:22)
转膜时间与你使用的是什么品牌的转印槽有关系。如果你使用的是BIO-RAD的mini湿转,40V,3h这个条件我认为不合适。当然,你一定要参照你们实验室之前的实验条件。
50KD和80KD这个分子量的蛋白,应该属于大分子量范围。
我推荐如下:
1.将转印条件改为100V,120min(针对bio-rad mini湿转)
2.检查上样量,总蛋白控制在10ug。不要过大。
3.根据你的Marker出条带,二抗应该问题不大。检查一抗是否失效,是否稀释妥当。
4.曝光时间做梯度,3min为基准。如果Marker还像上边那张图一样不清晰,则增加时间。反之减少曝光时间,直至3-5s。
30moonriver (2013-12-13 23:03:56)
看你提取的方法是否正确,我之前用RIPA提取的也是没有做出来,一般膜上蛋白不好提,所以我用专门的膜蛋白提取液做出来了!我不知道你机子什么型号,我也觉得转的时间太长了,你可以咨询一下厂家,或者你放两张膜,然后用丽春红染一下,看第二张膜上有没有蛋白条带,还有你蛋白上样量多大?太大的话很容易淬灭,所以减小上样量看看!还有你用的ECL是什么的?你一抗浓度是不是太高了,还有二抗?
阿司匹林 (2013-12-13 23:04:21)
根本不存在萃灭的可能,我试过萃灭是什么样的:中间某一区域是透明的,周围是黑色一片。你可以看他的底片,怎么可能是萃灭,那完全是什么东西都没有嘛。
ii077345 (2013-12-13 23:04:40)
我换了进口的ECL(Thermo)做了一次,一抗浓度提高一倍1:500,二抗1:5000,压片30min,中间各别泳道隐约出现一些非特异条带,marker条带没有了,目的条带还是没有。
谢谢各位战友的指点,我会继续摸索条件,(例如改变转膜条件)另外我怀疑蛋白有降解,我刚订购了一盒蛋白酶抑制剂cocktail,这两天培养箱故障,得过一段时间才能养细胞提蛋白了
ha111 (2013-12-13 23:04:57)
你可以试试再重新做一次,转完膜后染胶看看
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