【求助】蛋白挂上q柱洗不下来

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-12-13 23:23 作者: 红袖添香来源: 分析测试百科网

我的一个蛋白由于挂了nie柱后纯度不高，想通过进一步提高纯度，由于等电点在5附近，将其在ph7.5 50mm Tris 的条件下过Q柱，通过提高NaCl的浓度将其洗涤下来，随着盐浓度的升高，在800mm的浓度下，洗下了少量目的蛋白，但大部分蛋白都还留在柱中，将盐浓度升高到1M,2M也没有蛋白洗涤下来，请大家帮我分析分析。将该蛋白在ph6 50mm pb的条件下过sp柱,也遇到相同的情况，目的蛋白结合上之后洗不下来。

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【求助】蛋白挂上q柱洗不下来

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veiwu (2013-12-13 23:24:05)

蛋白疏水性强，吸附后聚集。

加尿素慢速洗脱。
红袖添香 (2013-12-13 23:24:30)

”谢谢你，吸附后聚集，是不是就是沉淀在上面了？用尿素不是变性了么，蛋白洗涤下来也不能用了吧，如果加尿素需要多大浓度比较合适啊。
veiwu (2013-12-13 23:24:55)

不敢妄加猜测是否沉淀了。

我遇到过相同情况，用尿素洗脱可行。

我用的是8M尿素。低浓度尿素是否可行没有做过试验。

尿素洗脱后的蛋白，可以按照包涵体纯化样品进行复性去除尿素。

去除尿素后的蛋白质样品，能否应用要看你纯化这个蛋白的目的是什么。
ALALA (2013-12-13 23:25:19)

降低缓冲液ph至6.5或6.0的条件下过Q或DEAE柱，以降低目标蛋白与层析柱的吸附力，然后用NaCl梯度洗脱。感觉你的蛋白不稳定，由于你提供的信息少（蛋白信息和操作方法），不好做进一步推论。
veiwu (2013-12-13 23:25:41)

你说的蛋白不稳定是指它容易降解么，挂q柱的操作方法就是：先用PH 7.5 50mm的tris平衡柱子，然后挂蛋白，然后分别用含100mm 200mm,400mm,800mm NaCl的PH 7.5 50mm tris的缓冲液洗涤。在800mm NaCl的情况下能洗下少量的目的蛋白，但大量的蛋白还残留在q柱上，我也在ph7.0相同的条件下挂过q柱，也是出现相同的状况。该蛋白的亲水性，溶解度还比较好，但在该蛋白前面含有一段穿膜肽，穿膜肽疏水性比较强。ph6.5没有结合过q柱，但ph6.0结合过sp柱，在该条件下蛋白结合在sp柱上，利用ph梯度洗脱，能洗下蛋白，但是杂蛋白也一起下来了，达不到纯化的目的。
ALALA (2013-12-13 23:26:00)

1、蛋白不稳定是指蛋白变性后沉淀在柱上，用盐洗脱不下来；
2、在你上述实验的基础上，即ph7.5的缓冲液，800mM的NaCl洗脱后，再用0.5N NaOH+1N NaCl洗涤，看是否有蛋白峰；
3、降低pH至6.5或6.0进行DEAE层析（不一定要用q），以降低蛋白与层析柱的结合力，看是否能全部洗脱下来；
4、利用穿膜肽疏水性强进行疏水层析，可选用GE的Butyl FF进行实验。可以直接进行此项实验。
5、感觉是蛋白与Q柱非特异性吸附至高盐洗脱不下来（推测）。
祝顺利！
ALALA (2013-12-13 23:26:19)

补充：
sp层析不要用pH梯度洗脱，pH梯度洗脱有专门的柱子，一般的柱达不到pH均匀分布。
ukonptp (2013-12-13 23:26:37)

“高盐浓度下即使是离子交换的柱子这时候疏水相互作用也会使蛋白不被洗脱,大家可以试试DEAE或Q柱就知道,所以除变性的因素外,疏水相互作用也不不能忽略的,只是通常的书上不说这个问题,所以说离子交换严格说来并非只有离子作用力,特别是高盐或者疏水强强的蛋白,这样的干扰更明显,这也是离子交换分离时虽然峰不少,但是一些峰组分却差不多的原由.
选择的pH和等电点近,高盐蛋白变性沉淀在填料中用多少盐都洗不下来,这很正常.个人觉得选择阳柱也许更好点.”

DEAE有4-5个碳原子,这样高盐情况下疏水相互作用变成主要作用力。个人觉得如果是疏水作用引起的，你可以试试洗脱液中加甘油或乙二醇，降低填料和蛋白间疏水作用（园子里常有疏水柱挂蛋白洗脱不下来的解决方法，可以搜搜）。另外，测一下你加盐的洗脱液的PH值，NaCL的加入对你的洗脱液的PH值会有些影响，不要离你的等电点太近。
mickeylin (2013-12-13 23:26:57)

楼主最好提供一个过Ni柱之后的电泳图谱，看看你的目标和杂质的位置，看看能不能想办法在第一步就把蛋白搞纯一点。甚至纯化搞了很久才发现可能在源头上蛋白表达就没折叠好，那些杂质结合在你的蛋白上面