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【求助】关于GST融合蛋白纯化
【求助】关于GST融合蛋白纯化
我在纯化我的GST融合蛋白的时候遇到了这个问题：在我的洗脱液中除了有我的37KD的目的蛋白外，还有一条27KD的蛋白带，这条带应该是GST，重复了好几次，还是这样的情况
不知道哪位朋友遇到过这类的情况，怎么才能避免洗脱液中还会把GST也一起洗脱下来，望多多指教！
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【求助】关于GST融合蛋白纯化
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-12-14 15:05 作者: qhyu 来源: 分析测试百科网
最新回复
jkobn (2013-12-14 15:05:55)
【专题讨论】^^^^^不同的目的蛋白在pGEX上表达纯化后，均遇到了一条杂带，看着很诡异（附图）^^^^^
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/15312605')
qhyu (2013-12-14 15:06:18)
那是GST断裂的缘故？还是GST翻译提前终止造成的原因大呢
jkobn (2013-12-14 15:06:50)
QUOTE:
根据上面的帖子分析，GST翻译提前终止的可能性较小。有可能是GST从N端断裂了10kd；
也有可能是翻译的起始点错误了，从N序列的10kd后开始。
低分子量蛋白带有少了10kd的GST融合头，以及完整的C端目标蛋白。
少了10kd的GST融合头依然对GST亲和柱有亲和性，但与完整的蛋白有差异。
少了10kd的GST融合头在做WB时，可能抗体针对的抗原位点依然存在，所以WB表现阳性。
qhyu (2013-12-14 15:07:33)
那这样的话，是因为我超声造成的吗？问题是我小量诱导的时候，那个27KD的蛋白带也会随着诱导时间的延长，合成量也增加，那就说明这条带应该是GST，GST的标签不就是27KD吗？
那就可能是翻译提前终止的缘故了？？我用的是PGEX-KG的载体，用的EcoRI和SalI酶切位点，是不是我选的酶切位点不合适，造成连上我的目的片段后，mRNA不稳定？
还有一点比较奇怪的是，我在构建这个重组载体的时候，双酶切验证并没有切下我的目的片段，但是测序表明我的目的片段的确正确插入了，很怪异。。。
因为第一次遇到这种情况，还望给些建议，怎样才能避免GST的单独表达，另外我纯化这个蛋白，后期主要是为了做pull down实验，如果纯化的蛋白有GST单独表达的话，会影响我后期的pull down实验吗？
huifeng0516 (2013-12-14 15:08:05)
尝试37℃加热2小时制备电泳样品，而不是95-100℃加热5min。
蒲公英 (2013-12-14 15:08:27)
QUOTE:
纯化后洗脱液可以不加热变性直接用sds loading buffer跑出来都没什么区别的loli (2013-12-14 15:08:49)
我也存在相同的问题，不过我用的MBP-fusion蛋白，不知有没有好办法。
huifeng0516 (2013-12-14 15:09:21)
1、样品制备采用95-100℃加热5min是使蛋白变性，改变其天然结构，使SDS更能打开分子内部的氢键、疏水键，并结合到蛋白分子上，形成椭圆棒状的蛋白质-sds复合物；
2、95-100℃加热5min在使蛋白变性使分子呈线性的同时，也易使一些蛋白（常见融合蛋白，如GST融合蛋白、两活性分子连接的融合蛋白）分子断裂；此步为本人的推测，没有文献支持，但后面的实验可间接证明；
3、样品制备采用37℃加热2小时也可使蛋白变性且形成蛋白质-SDS复合物，但如样品中混有蛋白水解酶时，则可能使目的蛋白水解，出现假阴性结果；
4、XDJM们可采用95-100℃加热5min、37℃加热2小时及70℃加热10min制备同一样品，然后电泳，比较结果；
5、做药的XDJM可查看英国药典的SDS-PAGE法，样品制备中没有规定加热温度和时间。
6、参考文献：生化实验方法和技术，张龙翔主编，高等教育出版社1981年版，P116；英国药典相应方法；欧洲药典相应方法。
祝顺利！
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