【求助】蛋白电泳怪现象

最新回复

• whitesheep (2013-12-14 17:09:34)

  
  我的蛋白正好在20kD处，这个样子的话，根本看不到目的条带 。郁闷中。。。

• 12xunmei (2013-12-14 17:09:55)

  
  先给你说一下我的步骤吧，
  1。动物组织剪碎，PBS洗两遍
  2 碧云天RIPA细胞裂解液，与PMSF100：1混合，
  3 冰上裂解40分钟（每15分钟剧烈震荡一次）
  4 4度12000转离心15分钟，
  5 BCA测蛋白浓度（最好是测一下，这样会有个大概的上样量）
  6 蛋白变性 蛋白：buffer=3:1（加入5倍的上样buffer我认为是不正确的），95度10分钟 （我的习惯是把所有的蛋白一次变性然后放-20备用，因为害怕蛋白降解）
  7 12.5%胶（这个应该根据蛋白的分子量定，不过我们实验室30KD一下的也用这个浓度的胶 做出来了）
  8 预电泳 恒压80v 30分钟
  9 上样 浓缩80v <20分钟，分离100v <90分钟（这要根据分子量定电压）
  我认为从你给出的步骤可能有几个原因：1 蛋白上样量太大（看图感觉可能性不大）
  2 buffer量太大，蛋白稀释太多（这个可能性较大）
  3 胶出现问题：浓度不合适，或配胶用的液体不合适

• 12xunmei (2013-12-14 17:10:20)

  
  配胶的液体不合适意思就是有的液体要避光，有的要在一定时间内用完，有的要求调PH值，有的要避光，过会就给你液体配方，这只是我自己的意见。

• 12xunmei (2013-12-14 17:10:38)

  
  WB 液体配方
  A液： 29.2g丙烯酰胺、 0.8g甲叉双丙烯酰胺，一级水（三蒸水）定容至100ml,完全溶解后 0.45微米滤器过滤，4度避光保存（1个月）
  B液： 18.15gTris加适量一级水溶解，用盐酸调PH值至8.8，一级水定容至100ml,4度保存
  C液： 6.05gTris加适量一级水溶解，盐酸调PH值至6.8，一级水定容至100ml，4度保存
  D液： 10gSDS，90ml一级水溶解后，定容至100ml，室温保存。
  E液： 10ml TEMED，加一级水100ml,4度避光保存
  F液： 0.1gAPS，一级水溶解至1ml,4度保存（1周内用完）
  备注： A、B、C液建议都用0.45微米的滤器过滤。

• langlang (2013-12-14 17:11:01)

  
  以前也跑出过这样的一板胶，当时自己将其命名为“哭笑不得”。
  
  蛋白条带“哭笑不得”产生的原因：
  上样量过大，或者电泳时电压（电流）过大能让蛋白条带微笑；而SDS胶制备的不好（各成分未充分混匀，胶凝固时间不够等）多半会让蛋白条带哭泣；如果上述原因共存，那蛋白条带只好哭笑不得了。
  
  另外，我猜想你没有做蛋白定量（仅限于该电泳结果哈），建议还是测一下样品蛋白浓度，然后将各样品调整到统一的浓度，再加入上样buffer变性。这样能保证相同的上样体积和蛋白量。

• greenbee (2013-12-14 17:11:36)

  
  顶！
  最近也被同样的问题所困扰，尝试过很多方法：如减少上样量、减小电压、让胶的凝固时间延长。但仍无任何改善。
  非常希望强人能一针见血的指出关键因素在哪里。
  泣血求，万分感谢！！！

• uaubc (2013-12-14 17:11:58)

  
  我可以肯定的告诉你：把你的所有制胶溶液全重新配，然后调整上样量，100ul 碧云天的细胞裂解液，裂解1*10^6个细胞，上样量10ul，条带肯定清晰。但是，问题是：
  我跟你做的东西是差不多的，虽然我的条带很清晰，但是，20kDa以下的蛋白，条带越来越暗，像弥散一样，这个问题，我还没有解决。。。
  我现在去发帖，请楼主关注我的求助贴，期待高人出现。

• tangxin_80 (2013-12-14 17:12:22)

  
  1，建议提高胶的浓度试试看（15%）
  2，裂解好的蛋白用pbs稀释一定倍数，和终浓度1*上样液混合变性后，高速离心5min，然后点上清，降低裂解液成分的影响。

• uaubc (2013-12-14 17:13:00)

  
  提高胶浓度无济于事，因为他的Marker都跑成那样。
  你的问题就是：电泳的制胶溶液很陈旧了，懒得更换新的。你换成新的，我保证你跑出漂亮的图。