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【求助】SOS原核表达表不出来
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目的基因1600多个bp，目的蛋白62KD，采用的PET-28a载体，NcoI和XhoI双酶切连入，his标签连在目的基因后面，连入载体后测序完全正确，没有移码突变，宿主菌ROSSETTA。
已经试验了很多条件，包括OD600=4的时候加入IPTG，
0.1-1mmol/L IPTG，
37度、30度、28度，
诱导4-6个小时都试过了，蛋白电泳一点也看不出来
注意到一个现象，加入IPTG后，菌似乎很不容易变浑浊，OD值跟加入前变化很小。
在坛子上看了很多相关帖子，感觉该考虑的都考虑到了，可就是不出结果，急死了，恳请各位帮忙。
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最新回复
33号 (2013-12-14 17:14:21)
IPTG是什么时候配的？看到你好像没考虑到IPTG是否还有效这一条啊，很有可能是IPTG时间过长，重配一下试试，我以前也碰到过这种情况，换了IPTG后就好了。IPTG 一次最好不要配太多，用完再配。
junhun (2013-12-14 17:14:43)
谢谢楼上的建议，
我的IPTG是最近用粉末配制成的200mg/ml储存液，粉末是实验室以前留下来的，放在-20度，不知道多长时间了，IPTG干粉在-20度会失效吗？
另外，我加入IPTG后，菌的生长明显受到抑制，这能说明IPTG有效吗？
小糖块 (2013-12-14 17:15:30)
宿主菌是ROSSETTA 还是 ROSSETTA(DE3)?
junhun (2013-12-14 17:15:59)
宿主菌是ROSSETTA(DE3)
我以前就用这个菌表达过蛋白，而且表达出来了，不过以前那个蛋白比较小，很容易就表达出来了。
我该怎么办呢？换载体吗？除了PET-28a还有什么好表达载体
查了一下序列，共有12个AGC，16个AGG，10个CCC，8个AGA，6个CTA，6个GGA，5个CGA，稀有密码子算多吗？ROSSETTA(DE3)应该能用吧？
junhun (2013-12-14 17:16:17)
还有一个问题，如果30度，1mM IPTG诱导5小时一点表达都没有是不是就没有希望表达了
dongdongqiang (2013-12-14 17:16:44)
OD600=4的时候加入IPTG，菌是否太老了？一般菌液稀一点表达反而好，最好控制在OD600<1.0 .
加入IPTG后，菌似乎很不容易变浑浊,是否目的蛋白对细胞有毒性？若是毒性蛋白就很难表达了。
mamamiya (2013-12-14 17:17:15)
junhun (2013-12-14 17:18:44)
谢谢各位，我那个实验室调节比较差，18度肯定达不到，我再低点温度试一试吧
plaa (2013-12-14 17:19:24)
建议：
1、认真确认目的基因克隆正确，具有ATG起始密码子？
2、多挑一些克隆，有时候克隆有表达水平高低之分；
3、试试别人正在用的IPTG，看看是否自己的已经失效；
4、有的时候电泳看不到不表示没有蛋白质的表达，如果有生物学活性的话可以通过测活来鉴定目的蛋白的表达。（或者可以尝试不同的裂菌方法，至少我见过一例溶菌酶电泳无结果，但是超声以后表达水平还很高的）
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