【求助】表达菌BL21(DE3)的菌液PCR

最新回复

• 131415 (2013-12-15 11:37:14)

  QUOTE:

  原帖由 memory 于 2013-12-15 11:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  各位老师，我把质粒pET28a（含目的基因）转化到BL21（DE3）里，涂板后挑取菌落做PCR，六个都是阳性，但是等到把挑的菌接到LB培养基里面摇起来之后取1微升做模板做PCR，结果都是阴性的了。不知道是什么原因，希望各位老师给予指点。 ...

  做一下酶切看看是不是阳性的呢？

• boom (2013-12-15 11:37:38)

  QUOTE:

  原帖由 memory 于 2013-12-15 11:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  各位老师，我把质粒pET28a（含目的基因）转化到BL21（DE3）里，涂板后挑取菌落做PCR，六个都是阳性，但是等到把挑的菌接到LB培养基里面摇起来之后取1微升做模板做PCR，结果都是阴性的了。不知道是什么原因，希望各位老师给予指点。 ...

  都挑了做PCR了，你怎么拿同一个菌落摇LB的？？

• jujuba (2013-12-15 11:37:55)

  
  挑去做PCR又不会挑得很干净咯，一般都是拿牙签刮一点点。取剩下的接LB摇。

• jujuba (2013-12-15 12:33:07)

  楼主第二次PCR有没问题呢？

• boom (2013-12-15 12:33:54)

  
  恩，你的菌液污染了，摇出来的都不是你的克隆菌，比如卫星菌落什么的

• bling (2013-12-15 12:34:18)

  
  首先要排除PCR体系本身的问题，做一个positive control，证明PCR体系没有问题。
  在排除了PCR体系问题的前提下，阴性的原因可能有以下几种：
  1：转化根本没成功，涂板后挑取菌落做PCR，六个都是阳性，原因是因为转化后直接涂平板，连接产物或者没有连接上的目的基因都涂在了平板上，挑菌落做PCR的时候将未转化的连接产物或者没有连接上的目的基因挑了进去做了模板。
  2：转化时使用的抗生素失效，长出的根本就不是含有表达质粒的菌落
  3：挑的菌接到LB培养基培养时使用的抗生素已经失效，致使质粒丢失。
  解决办法：
  摇菌提质粒，用质粒做模板做PCR。阳性则直接送测序，阴性的话就重做吧。
  祝好运！

• mamamiya (2013-12-15 12:34:41)

  我觉得楼上说的都很有道理，你接LB培养基的抗性用对了吗？