【求助】凝胶柱分离策略？

最新回复

• wmp1234 (2013-12-16 17:19:54)

  按理说是1x100cm的分离效果好，但是其直径比较小，柱壁效应比较大，另外就是柱压会比较高，尤其在填料颗粒较细的情况下； 1.6x80cm的分离效果可能会差一点，但是操作起来相对容易，而且能够把你的蛋白分开，但是这个柱子用的填料要相对多一些。

• bring (2013-12-16 17:20:21)

  
  按你说的这个2个分子量的蛋白，G75如果是完全分不开，Superdex 75估计也够呛，应该是蛋白本身的问题

• DONT (2013-12-16 17:20:46)

  
  两种柱子的直径都比较小，相应的柱体积不多，上样量有限，这就和操作熟练程度关系莫大了。
  
  装柱、上样操作尤为重要。建议找预装柱做。
  
  能否分开事先不能预测，因为你的电泳是60和20kd，但样品的实际情况是否如此是不一定的。或许有二硫键，或许有疏水性多聚体。

• DNA (2013-12-16 17:21:05)

  你要考虑这个20 kD的蛋白是不是多聚物，如果是3聚体，凝胶柱是分不开的
  看看等电点吧，或许还是离子柱分开
  最好交代一下你的原始材料，纯化步骤

• huifeng0516 (2013-12-16 17:21:28)

  
  换sephadexG-50试试，分离范围在1500-30000，这样一个在胶中走，一个直接穿过，应该能分开你的两个蛋白了。

• cbou876 (2013-12-16 17:21:58)

  
  谢谢各位高手指点 我的样品是先经过一步离子纯化后得到的 然后想用凝胶柱再细分

• xingyi08 (2013-12-16 17:24:48)

  
  试试30kd的超滤管，简单快速

• redbutterfly (2013-12-16 17:25:16)

  QUOTE:

  原帖由 xingyi08 于 2013-12-16 17:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  试试30kd的超滤管，简单快速

  这个方法是行不通的。

• zsxan1990 (2013-12-16 17:25:42)

  
  要是简单的球形蛋白，当然可以用分子筛，要是线性，嘿嘿，那就麻烦咯

• utt0989 (2013-12-16 17:28:14)

  试试30kd的超滤管，简单快速
  
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  你那有超滤管的使用说明没？期待~~

• cbou876 (2013-12-16 17:28:44)

  
  超滤管分我觉得有点悬，因为之前用过分蛋白差异很大的却分不开。所以，自己装了一个superdex75 1.0x80，做了几次分别是了0.20.30.5ml/min,但是还是分不开，只有一个峰，电泳结果还是在一起，还有就是我认为这两蛋白之间应该没有相互作用，因为用非还原sds-page结果与还原sds-page一样，各自的条带并没有发生变化。希望大家给出好的建议....

• pengke1983 (2013-12-16 17:45:49)

  30kd的超滤管能透出20kd的蛋白吗？
  
  建议查阅截留分子量的定义。

• hold住 (2013-12-16 17:46:33)

  30kd的超滤管能透出20kd的蛋白吗？
  
  建议查阅截留分子量的定义。
  
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  30kd或50kd的，一次可能不能完全分开，但多重复超滤几次，应该还是有效果的。

  
  17587060.snap.jpg

• bring (2013-12-16 17:47:07)

  30kd或50kd的，一次可能不能完全分开，但多重复超滤几次，应该还是有效果的。
  
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  多谢提供依据。
  
  我没有做过那么多超滤的比较试验，但超滤是我很常用的。
  
  在我的经验中，用截留5kd的超滤基本上是完全去除不了3kd的蛋白，用截留10kd的超滤基本上是完全去除不了7kd的蛋白，用截留30kd的超滤基本上是完全去除不了20kd的蛋白，用截留50kd的超滤完全去除不了30kd的蛋白，用截留100kd的超滤完全去除不了50kd的蛋白。
  
  我所说的完全去除不了的意思是在超滤透出液中电泳完全看不到这个分子量的蛋白，而是保留在超滤液中。
  
  超滤的产品设计是用来进行浓缩和缓冲液置换的，而不是以分离纯化为目的。所以超滤产品的注重点在于截留蛋白而不是在于透出蛋白。反映在超滤膜的制造上，是控制不规则膜孔中大孔径的分布，而不是小孔径的分布。换句话说，就是要保证在这个截留分子量上方的蛋白有着95%以上的截留率，而不考虑在这个截留分子量下方的蛋白有多少的透过率。
  
  你要是向超滤膜或超滤管的生产厂家咨询，他们是绝对不会保证30kd的超滤膜能够透出20kd的蛋白，甚至不会保证能够透出多少比例10kd-5kd的蛋白。他们能够保证的是30kd以上蛋白的截留率。
  
  那么，不同截留分子量的超滤膜的使用差距主要在那儿呢？例如，150kd的蛋白用10kd、30kd、50kd和100kd的超滤膜都可以完成超滤浓缩和换液的目的，差距在于超滤的速度不同。截留分子量大的膜其超滤透出缓冲液的速度明显要大得多。所以，超滤膜的选择是在保证目标蛋白的截留率的前提下选择快速的高分子量膜。
  
  一点探讨，大家也可以来说说自己的看法。

• cbou876 (2013-12-16 17:47:35)

  
  我非常同意楼上的观点，因为这是在实际的实验中确实是会出现的现象。再是，超滤管的截留分子量都是用的规则的球蛋白测量，但是实际上很多的蛋白并不是球形的，所以就即使是分子量与球状蛋白相同但也不一定能离到下面。
  多谢各位分享经验，本人还是希望大家能够给予好的建议，尽快将其分开。