【求助】请教蛋白表达的细节问题

最新回复

• quiqui008 (2013-12-16 21:47:21)

  诱导表达后直接跑胶的话，因为包含有菌体的蛋白，一般会有非常多的条带，如果不做阴性对照（未诱导或者转了空载的菌）的话就不能确定目的大小附近的条带到底是不是你的目的带，所以没必要做银染，如果通过对照，没有目的条带或者同一条带亮度增强不明显，很有可能就是没表达出来，就要检查原因了，可以先确定是否转化成功，是否是表达条件的问题，都没问题的话可能就是你的序列和载体方面的原因了。
  
  超声的话我都是从300w，开始摸条件，慢慢增加超声时间或者次数看什么时候到达澄清，或者相对澄清，像我现在这个蛋白就超不到澄清，超声的话等待高手指教
  
  诱导表达时我是在通过跑胶确定有目的条带后再做western验证，是用的his抗体，我们实验室目前使用的是国产的，感觉要是想省钱的话，国产也够用了吧

• 雪山飞鹿 (2013-12-16 21:47:42)

  
  谢谢楼上的回复
  
  参考几篇文献发现我表达这个蛋白本身就是表达量比较小，这样即使设阴性对照也很难看出来条带，所以想通过其他方法（银染、WESTERN）进一步验证一下---
  
  超声我也做了几次，结果上清和沉淀跑SDS--PAGE也基本看不到目的条带
  
  就是跑胶后看不到目的条带我才打算通过特异性强的方法做WESTERN的，，his抗体是不是还分H1和H3两种啊？你用的是国产哪个公司的？

• jingling845 (2013-12-16 21:48:38)

  
  对于1mL菌液，离心后收集菌体，加入100uLbuffer，超声通常200W,打4s，停4s，8次就可以了，如果不澄清，再打也不会由改善的。打完之后离心，分开上清沉淀，分别跑胶。

• 雪山飞鹿 (2013-12-16 21:48:55)

  
  不同的蛋白诱导后超声的条件应该是差别挺大的呀，，超声通常200W,打4s，停4s，8次？？？
  
  我表达的这个蛋白是表达在细胞膜上面的

• jingling845 (2013-12-16 21:49:23)

  
  膜蛋白啊？那肯定难表达啊，就算有也应该在沉淀里面。而且膜蛋白也不应该用超声法来提取，应该是用去垢剂有专门的方法提取的，你可以查一下文献

• 雪山飞鹿 (2013-12-16 21:49:43)

  
  这个蛋白就是比较难表达，完整基因预测有7个跨膜区，麻烦哦---
  
  至于表达的蛋白在上清还是沉淀应该也不是确定的吧，和诱导条件等都有关系的，，我看一篇文献人家做的这个蛋白的就是在上清中表达，，她只用了盐酸胍处理破碎后的沉淀

• pou (2013-12-16 21:50:05)

  不知道你western结果怎样了，有没验证出来呢？

• 雪山飞鹿 (2013-12-16 21:50:27)

  谢谢楼上的这么关注
  
  由于试剂还没有准备好，还没有做WESTERN 呢，出来结果了肯定上来说下

• sunnyB (2013-12-16 21:51:01)

  这个蛋白就是比较难表达，完整基因预测有7个跨膜区，麻烦哦---
  
  至于表达的蛋白在上清还是沉淀应该也不是确定的吧，和诱导条件等都有关系的，，我看一篇文献人家做的这个蛋白的就是在上清中表达，，她只用了盐酸胍处理破碎后的沉淀
  
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  用盐酸胍处理破碎后的沉淀,说明不是上清表达了。盐酸胍是强变性剂，溶解膜蛋白。

• 雪山飞鹿 (2013-12-16 21:51:27)

  
  谢谢楼上指教，我这个蛋白诱导了200ml，但收集的菌体好少哦---
  诱导后的菌液200ml超声后底部只剩很少沉淀了

• 雪山飞鹿 (2013-12-16 21:52:27)

  
  我刚做了一次western，丽春红染色后发现有略大于35KD和近50KD两条带---不清楚这个结果算什么哦？
  
  请教帮我分析一下啦

• 雪山飞鹿 (2013-12-16 21:55:47)

  请教用盐酸胍溶解包涵体之后如何处理样品才能跑SDS-PAGE？
  直接用盐酸胍溶解的包涵体+上样缓冲液经煮沸后上样发现刚开始样品好像跑不动啊--也影响临孔样品的迁移