【求助】纯化过程中出项双峰

最新回复

• luoliqiong (2013-12-16 21:57:23)

  可能和蛋白的空间结构的折叠有关吧
  
  凝胶柱时蛋白是非变性的，根据蛋白的空间排阻大小来分离蛋白。
  
  SDS-PAGE时蛋白是变性的，蛋白完全展开，分子量决定了其电泳迁移率。

• 宁小胡 (2013-12-16 21:57:51)

  QUOTE:

  原帖由 skytree 于 2013-12-16 21:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  在做大肠杆菌表达的EGF纯化过程中，用了四部柱子的方法，包括两部离子交换柱，一步疏水柱，还有最后的凝胶柱，凝胶柱时，会出现两个大小差不多的峰，利用SDS-PAGE检验发现两个峰具有相同的分子量，HPLC纯度显示前锋的纯度没有后峰高 ...

  是形成聚体了

• skytree (2013-12-16 21:58:14)

  谢谢各位的回答
  那请问，该如何证明一下这种现象呢
  如果是聚合体的话，是不是用氧化型SDS-PAGE可以看出来呢
  谢谢

• 宁小胡 (2013-12-16 21:59:06)

  是还原型电泳可以看出来

• jujuba (2013-12-16 21:59:31)

  QUOTE:

  原帖由 宁小胡 于 2013-12-16 21:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  是还原型电泳可以看出来

  更正，是非还原型电泳。
  
  但是非还原电泳只是个充分条件，不是必要条件。
  
  也就是说，非还原型电泳如果是多条带，那么可以说样品有多聚体。但是，样品有多聚体不一定能在非还原电泳中显露出来。例如，疏水聚合的多聚体就不能通过非还原电泳判断。

• leifengta (2013-12-16 22:00:15)

  
  非还原电泳和还原电泳对比起来就能确定了

• skytree (2013-12-16 22:00:39)

  
  我做了一次还原性和非还原性的电泳，结果是没什么区别，请问什么怎么能判断是不是疏水性的多聚体呢？
  谢谢

• tudou85 (2013-12-16 22:00:57)

  是不是疏水作用力或离子力形成的聚体呢?

• kuohao17 (2013-12-16 22:01:15)

  
  可能有一个峰是聚集体 你跑maker看看
  另外凝胶柱也只是表观分子量 跟大小，形状有关，疏水柱能不用就不用，有点坏蛋白，折叠坏了可能会导致出现两个峰，在复性蛋白的过程中，凝胶柱上折叠好与不好的也有出两个峰的
  可以的话 给你这两个峰的蛋白扫个CD吧

• dreaming (2013-12-16 22:02:01)

  
  "凝胶柱时，会出现两个大小差不多的峰"具体是什么凝胶？一般凝胶柱分离蛋白是同时根据蛋白的分子量和表面电荷来分离的因此“两个大小差不多的峰”出现，如果两者靠的很近，则基本不可能是由于蛋白想成了二聚体或者多聚体。您的结果显示：这两个峰因该是同一蛋白，但是其中有部分蛋白，正如楼上分析的很可能发生了变性，导致蛋白的表面电荷有所改变，但并非降解，所以蛋白质的分子量并没有变化。所以以后再纯化蛋白质，最好，加个His之类的tag，这样省时省事，你如果不想要tag纯化以后还可以切掉，你四个柱子一用，产率会大大降低，并且很耗时。
  good luck!

• ALALA (2013-12-16 22:02:25)

  QUOTE:

  原帖由 dreaming 于 2013-12-16 22:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  "凝胶柱时，会出现两个大小差不多的峰"具体是什么凝胶？一般凝胶柱分离蛋白是同时根据蛋白的分子量和表面电荷来分离的因此“两个大小差不多的峰”出现，如果两者靠的很近，则基本不可能是由于蛋白想成了二聚体或者多聚体。 ...

  更正几个不确切的地方：
  1、凝胶过滤（Gel Filtration）也叫分子筛层析，分离的依据就是蛋白质表观分子量的大小，与电荷无关。
  
  2、变性和结构变化非等同概念。变性包括了结构变化，但结构变化不一定变性了。
  
  3、变性不一定会造成蛋白质电荷的变化。例如我们常用尿素来变性溶解包涵体，但尿素作用的主要是氢键和疏水键，基本上对蛋白质的电荷情况没有影响，所以我们还是可以用尿素变性后的样品做离子交换层析。
  
  4、靠得很近的两个差不多的峰也有可能是单体和多聚体，这和所用的凝胶柱类型，以及目标蛋白分子量有关，不能完全排除的。例如分离范围为3-70kd的superdex 75柱，如果目标蛋白单体为80kd，那么在S75柱时，单体和聚体都会走外水体积。

• sr9971 (2013-12-16 22:02:47)

  想知道楼主说的两个大小差不多的峰，到底差多少，单体分子量是多少，柱子是什么型号，有没有可能从别的文献知道它是几聚体？
  
  我在实验中一直担心 E. coli 用于表达的时候，基因的终止密码的终止效率问题。
  
  有文献指出，TAAT 是效率最高的终止密码，如果换成别的终止密码，可能会有更高的几率使翻译终止于后续片段上的终止子。
  
  如果楼主的蛋白质是多聚体，而翻译又是终止于后续终止子，完全有可能在 Gel Filtration 上出现多个峰。

• chuntian1983 (2013-12-16 22:03:49)

  
  此外也可能是蛋白立体结构不同，凝胶柱子还和形状有很大关系，所以也可能是异构体。前面的结构松散，后面的紧密。

• guagua (2013-12-16 22:04:13)

  
  想问一下各位老师，做离子交换层析时用梯度洗脱，假设是0-1m的NaCl，最终浓度能到1m吗？
  有看过一个公式，要是按公式算能到！但是我觉得无论怎样，最终浓度都是两瓶的混合，只能接近1m应该到不了1m吧！不知道对不对，请各位指点！谢谢

• yychen (2013-12-16 22:04:37)

  QUOTE:

  原帖由 guagua 于 2013-12-16 22:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  想问一下各位老师，做离子交换层析时用梯度洗脱，假设是0-1m的NaCl，最终浓度能到1m吗？
  有看过一个公式，要是按公式算能到！但是我觉得无论怎样，最终浓度都是两瓶的混合，只能接近1m应该到不了1m吧！不知道对不对，请各位指点！谢谢 ...

  看你用的是什么设备。
  
  如果用的是梯度杯的容器混合形式，理论上只能无限接近。
  
  但是如果用的是双泵控制系统，如AKTA，当梯度100%时，A泵完全停止，可以达到。

• koook5695 (2013-12-16 22:05:16)

  
  还是贴个图上来吧，关于凝胶柱其实峰形走的千奇百怪
  
  比如这个图：

  
  73203930.jpg