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【求助】跨膜蛋白的重组和纯化问题
本人要用重组蛋白为抗原免疫动物做抗体，因为我的蛋白是人的跨膜蛋白，而重组跨膜蛋白好像和重组可溶性蛋白有区别，更有难度。现请教各位几个问题，望帮忙解答（对这方面不太懂，可能问题有些傻，望理解）：【求助】跨膜蛋白的重组和纯化问题
1重组跨膜蛋白是用大肠杆菌系统好还是用真核细胞表达系统如cos7细胞等好？因为我的蛋白是人的。
2是否有什么办法使重组跨膜蛋白能表达在胞浆中或分泌在培养液中？
3如果不能，那用什么方法收集和纯化跨膜的重组蛋白？（我知道表达载体上加标签如flag,his等，去污剂破膜，利用此标签抗体能收集。我这里指的是跨膜蛋白易折叠聚合，易活性尚失，如何避免，如何提高产量）
4如果重组蛋白没有活性，是不是就不能用来免疫动物做抗体？因为产生的抗体可能不能和天然构象的蛋白相结合，导致生成的抗体无效？
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最新回复
NBA (2013-12-16 22:44:15)
哪怕是用蛋白的片断去免疫。
重组蛋白没有活性，是不是就不能用来免疫动物做抗体？不是的。
在这儿如果你的活性定义是什么？与商业化抗体的免疫结合活性？商业化抗体往往是单抗，重组蛋白与它不结合，不代表不能重组蛋白来做多抗。
总之，做自己试验室用的多抗，对重组抗原几乎没有什么限制。当然，如果是为了商业化就另当别论。
kuaizige (2013-12-16 22:44:35)
谢谢版主的热心解答。我现在的问题是用合成的肽段做出的多抗不能用于western blot，免疫组化都可以。所以想用重组蛋白做多抗试试，如果还不行，则可能要做单抗。这就涉及到蛋白构象的问题，有可能因为重组蛋白的构象与天然的不一样，导致做出来的多抗不能识别天然蛋白。
同时我的最大问题在于重组的是跨膜蛋白，而第二个问题是关键“是否有什么办法使重组跨膜蛋白能表达在胞浆中或分泌在培养液中？”。因为如果用真核表达系统，这个蛋白表达在膜上的话，必然导致回收的难度增高和效率降低。而用大肠杆菌的话，肯定是表达在包涵体中，而跨膜蛋白容易聚合沉淀，导致构象改变。
请您帮忙，先谢。
eric930 (2013-12-16 22:44:52)
1.有专门的真核表达系统，是利用加上Fc标签纯化出来，invitrogen就有卖的好像
2.我做过膜蛋白，我觉得制备多抗最难的就是，膜蛋白总是存在大量的糖基化修饰，
这样就给打出来多抗的特异性增加了难度，也就是说杂带很多。所以建议你多设计
片段去制备多抗
kuaizige (2013-12-16 22:45:17)
您说的invitrogen的Fc标签，我在官网上没有找到，可否告知？
【求助】跨膜蛋白的重组和纯化问题