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【求助】蛋白表达形成高聚！
大家好，我目前在做一个大概110kD的的蛋白，过完Ni柱后蛋白挺多的！经SDS确定是110kD的蛋白！后续经过浓缩后去做分子筛，结果发现8ml左右出来一个较高的峰，而正常13ml峰特别低，有时没有！8ml左右出来的是高聚，后来试过其他的方法！如添加DTT，10%甘油，改变NaCl浓度，改变pH值等都没有效，所以来问问大家有碰到过这个高聚的问题吗?有什么好的方法吗？推荐下，谢谢！！ 【求助】蛋白表达形成高聚！
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最新回复
喵咪 (2013-12-16 22:58:09)
你怎么确定8ml出来的就是你的蛋白的聚合体。有没有试过加表面活性剂如tween，sds之类的
viviwang1987 (2013-12-16 22:58:27)
8ml蛋白跑过电泳啊！确定是我的蛋白！对照该柱子的情况是分子量比我的大很多菜出来的，所以认为是高聚了！没试过表面活性剂，这个主要是什么作用？
txwuyan (2013-12-16 22:58:44)
我估计不是蛋白的高聚，你有没有检测一下你的两个峰，如果是杂蛋白呢。用你的检测手法检测一下
阿k (2013-12-16 22:59:03)
先低浓度上样看看，但是你这图上的吸收峰很低，看上去蛋白不多啊
xueyouzhang (2013-12-16 22:59:19)
过Ni柱后用SDS可能就有问题，应该用非还原电泳看看，可能已经形成高聚了。所以对付高聚要从开始做就要注意添加东西。
阿k (2013-12-16 22:59:38)
viviwang1987 (2013-12-16 22:59:54)
对，是SDS-PAGE确定是110kD，没有加SDS，上面那个图其实是5ml Ni柱（总共50ml）下来的蛋白跑的分子筛，估计Ni柱下来就高聚了! 而不是后面操作照成的！真不知道怎么办？
seagate (2013-12-16 23:00:26)
首先确定一下，你的得到的蛋白的目的，检测活性？如果是，活性形式是单体，还是多聚？
关于聚集，还原剂是全程加，还是洗脱出来后再添加的？浓度够不？最好跑一个非还原胶看看。
如果还原剂足够，那么聚集不是由于二硫键而引起，可能是疏水性聚集，打开的话需要添加表面活性剂或者其它解聚性的试剂。
seagate (2013-12-16 23:00:48)
跑SEC的时候，用NI柱的洗脱液做平衡液，这样可以知道聚集是因为换buffer，还是洗脱时就已经形成。
viviwang1987 (2013-12-16 23:01:16)
这个做过了！结果一样！还是一样形成高聚了！所以判断是在Ni柱中就形成高聚了，或者细胞破碎出来就高聚了！由于这个蛋白是结合DNA的，所以我下次打算直接在细胞破碎前的原液中加入足够量的DNA,看看结果怎么样！这样行吗？
dreaming (2013-12-16 23:01:40)
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