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【求助】奇怪的Western结果

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-12-16 23:02    作者: idoww    来源: 分析测试百科网

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【求助】奇怪的Western结果

本人一直在做CTGF的Western Blot（分子量38kD），但始终只有内参而无目的条带。最近做的这次，加大了上样量，转膜条件200mA 2小时。一抗4度孵育了三天（Santa Cruz的单克隆抗体，建议浓度1：100-1：1000，我用到1：50，最后一天在37度孵育了2小时），二抗4度孵育三天（奥德赛红外扫描仪的专用二抗，浓度1：4500，最后一天在37度孵育了2小时），奥德赛红外扫描结果可见蛋白条带，但非正常的黑色，而是白色（如图），想请问各位高人，是什么原因呢。因为从蛋白分子量来看，似乎是我要的蛋白，但为什么不是黑色呢，会不会因为二抗孵育时间太久了?或者有其他原因？眼看毕业在即，但WB始终没有结果，很是焦急，希望大家能给我帮助，非常感谢！
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  • idoww (2013-12-16 23:03:25)


    我刚才又认真浏览了一下版里的帖子，有人认为是抗体浓度和孵育时间的问题。因为之前我做的都没有结果，背景都是很干净的，所以我就根据别人的意见加大了抗体浓度和孵育时间。这次似乎有希望了，但确是白的。我准备把膜洗洗再孵一次，但用多少浓度，孵多少时间呢。恳请大家能给我些建议，谢谢了！

  • idoww (2013-12-16 23:03:47)

    先一步一步地，先电泳后染下胶看看，接着下依次再转膜后染一下膜，看是否有蛋白提取出来。

  • idoww (2013-12-16 23:04:16)

    我每次电泳后都染胶，染膜的，蛋白是有的。而且每次内参也是有的，可就是做不出来。真是急死了。

  • quiqui008 (2013-12-16 23:04:34)


    楼主santa的抗体种类很多很全，成熟的比如内参蛋白做得还是不错的，但是一些专门蛋白质量就……况且还是单抗，不知道楼主买抗体的说明书上有没有他们做的图例，如果没有，估计他们自己心里也没底的。

    如果楼主老板有钱的话，还是看看大公司有没有吧，这个交给你的供货商帮你去查就可以，如果没有楼主你做好屡败屡战的决心吧，多做吧，没别的办法。另外楼主孵育抗体的时间也太长了，我一般I抗4度过夜，II抗常温1h，你做出来那些条带我觉得是II抗和膜上的蛋白非特异结合的，这么做感觉意义不大。

  • idoww (2013-12-16 23:05:06)

    我是从来扫膜都是一片空白，连背景色都没有。所以只好想出增加抗体浓度和孵育时间的办法。可结果还是如此，想投诉，可投诉比买东西可难多了。主要是现在时间紧迫啊。不过，还是谢谢楼上战友的提醒。

  • vcve (2013-12-16 23:05:34)

    “膜上是白色，什么都没有”，是什么意思呢？仪器扫出来不应该是白色的啊，在你没有转化成黑白图片之前
    你的Odyssey二抗是700，还是800通道的？是不是二抗失效了。你的内参呢，能不能做出来

  • idoww (2013-12-16 23:06:02)


    “700，还是800通道的”？我不懂啊，机器都是设好的，我直接用的。通道不同会有影响吗？内参有的，但是比较淡。


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  • 30moonriver (2013-12-16 23:06:25)


    你的定影显影液有米有问题呢？

  • idoww (2013-12-16 23:06:52)


    我用的是奥德赛的红外扫描系统，用特殊的二抗，不需要定影显影
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