查看完整版本请点击这里：
【求助】WB转膜多次失败，求助！
【求助】WB转膜多次失败，求助！
相关疾病：
头晕
本人以往进行WB实验，较顺利，近一周以来，在转膜时忽然出现，MARKER一点也转不到膜上的情况，就是按既往时间转过后，看着是干干净净的一张白膜，有时候也会有淡淡的要转上去的迹象，但是再延长转膜时间（即使是原来的一倍时间），也不能转上。
第一次出现这种情况时，我所用的试剂和以前是完全一样的，转膜条件也是几乎一样的，所以我当时认为是转膜的仪器出了问题，但是随后有同学用相同的机器却转转的好好的，所以我排除了机器的问题。
第二天用相同条件在做，又没有转上，我考虑是不是甲醇的问题，因为这瓶甲醇有点久了，之后更换了新甲醇，再做另一块胶，还是没转上
第三天，我更换了新的电转液，接着做，还是如此
我想难道是MARKER的问题？我的MARKER是FERMETS的，买了有九个月了，感觉应该也没问题呀，
头晕！
现在特此请教，有没有哪位大侠碰到过这种情况，请指教一下，不胜感激！
查看完整版本请点击这里：
【求助】WB转膜多次失败，求助！
【求助】WB转膜多次失败，求助！
最新回复
guagua (2013-12-16 23:07:58)
chuntian1983 (2013-12-16 23:08:29)
温度低湿很大的问题，另外你延长转膜时间试试看。转不上去很有可能是时间不够。转膜有很多细节方面的问题，我们以前也碰到过这种情况，反复找原因，后来又一次转膜忘记时间了，本来只要转膜45分钟的，结果转了将近一个半小时，后来证明是时间不够。
douding66 (2013-12-16 23:08:49)
如果转膜条件跟以前实验用的一样的话，最大的变数应该是用的buffer了，建议你用同学的buffer做一次，因为不知道是不是你用的某个试剂的问题。另外正负极应该没有放反吧。
ztonyc (2013-12-16 23:09:11)
QUOTE:
buffer和这个关系大吗？你说的是marker还是buffer呢？能否再解释一下呀？ffaa (2013-12-16 23:10:08)
我觉得marker就是蛋白，如果没有降解的话（在SDS-PAGE上有条带），那应该没有什么问题。如果排除了marker和机器的问题，剩下的就是buffer了。我也不确定buffer可能有什么问题，但是你可以重新配一次buffer或者用别人的，以排除这个可能性。
莲花白 (2013-12-16 23:10:32)
用预染marker吧，转膜完成，有没有转上清晰可见
不过不知道你的转膜液是否有SDS，有的蛋白会因为它的存在而降低转膜时与膜的结合，可以考虑不要加
还原型电泳的巯基乙醇也可能有影响
一抗要适合做WB的那种
转膜时间一般不是问题，《100KD，湿转恒流200mA，60min没问题
u234 (2013-12-16 23:11:01)
检查一下正负极是否接反了，还有“三明治”的顺序问题。有什么一些小的方面可能是你忽略的，以上的这些错误我都犯过
newway (2013-12-16 23:11:20)
如果你用的是预染MARKER的话，这个问题就很好解决了。FERMETS有预染MARKER的，我现在一般只加3ul左右的转移效果都很好的。
最大的可能是你把转膜的电流的正负极放反了，如果是可视MARKER，没有转到膜有两种情况：一是停在胶上可见，另一种是电极放反了，结果MARKER不在胶上也不在膜上；我就有一次把电极放反了，结果可视MARKER一点也没转到膜上；
而你已经是个western 老手了，首先排除电流方向的问题，检查一下电转时电流的方向是否正确；
然后再检查一下转膜液的成分是否正确，现在用的甲醇要保证是甲醇，有时国产的试剂会搞错的，我就遇到过提RNA时的氯仿在加入TRIZOL后浮在上面，结果什么RNA沉淀也没有提出。
再就是，你在转膜时的转膜液的温度与冰盒是否正常，但这个因素不会影响到一点也转不上去；如果是有点淡淡的迹象，可能与你的转膜液的温度与电流过高有关系，
ztonyc (2013-12-16 23:12:01)
我用的是半干转，没做出来，找了很多原因，后来发现我做实验用的的那瓶甲醇闻起来有种淡淡的香味，于是又换新甲醇来活化膜，就好了。感谢各位朋友的热心解答。
【求助】WB转膜多次失败，求助！