【求助】纯化抗菌肽，选CM和DEAE柱的困惑

最新回复

• ritou1985 (2013-12-17 11:20:28)

  
  对于第一个问题，因为不是很了解你的样品处于一个怎样的环境，所以我想问。。。你的样品应该换了缓冲液的吧。。。
  
  第二个问题：你应该测一下穿透峰和各个收集峰有没有你的东西，有的话再往下做

• 杨过爱大米 (2013-12-17 11:21:01)

  
  我的样品换了缓冲液？是什么意思呢，我的样品是硫酸铵沉淀后用去离子水溶解，然后透析除盐，然后上离子柱。为了测试上哪种离子柱，我就用CM和DEAE去分别试。缓冲液用的是PH7的PBS。

• jkobn (2013-12-17 11:21:34)

  缓冲液用的是PH7的PBS。
  
  ===================================================================
  
  错在这儿。应该是PB，而不是PBS。
  PBS中含有氯化钠，电导有17ms/CN左右，一般蛋白都难以有效吸附离子交换柱了。

• 杨过爱大米 (2013-12-17 11:23:48)

  
  这几天一直断网没法上网，那老师我该选什么缓冲液呢，PB是磷酸盐缓冲液，可是应该选什么盐呢

• 杨过爱大米 (2013-12-17 11:24:06)

  
  因为以前有问过老师，我又看了一下以前的帖子，我就是用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配的缓冲液，这个是PB，以前老师纠正过了，呵呵。上面应该是表述的错误，其中并没有加氯化钠，就是PB，不含氯化钠，我是洗脱的时候才加的。但就是磷酸盐缓冲液的电导也有5.4ms/cm，这个算不算大？会不会影响蛋白挂柱？
  谢谢老师！

• 杨过爱大米 (2013-12-17 11:25:06)

  我想把过程写的详细些，大家帮我解答疑惑吧，谢谢了！
  过程：发酵上清-—加入硫酸铵，硫酸铵沉淀——沉淀物用去离子水溶解，调PH，测抑菌圈（有圈）——透析脱盐，检测活性（有活性）——上1ML的预装柱，DEAE和CM（GE公司，sepharose FF），平衡液是PH为7的PB（磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配置），洗脱液里PB里加入0.4M的氯化钠，梯度洗脱，0%B到100%B，时间40min；
  之后又用SP试，条件同上，SP在刚开始梯度B的时候有一个很平缓的峰 ，很小，但就仅此一个，之后再也没有了；
  
  结果：CM除了穿透峰，开始用B液梯度洗脱完全挂不上；SP有一很小峰出现，很平缓，是在刚增加B浓度时出现的，似乎挂不牢一样，然后再也没有峰；
  DEAE除了穿透峰，用B液梯度洗脱，随着B浓度增加，有三个峰出现；
  疑惑：为什么CM什么都挂不上，难道所有的蛋白此时都呈负电荷状态？我已经买了大柱子和DEAE填料（填料也是GE公司的DEAE sepharose FF），那CM还用不用买？还用不用试？

• 杨过爱大米 (2013-12-17 11:25:34)

  怎么没人回复啊，帮帮忙啊！！！因为第一次过柱所以有很多不明白，分离纯化的还是未知的物质，等电点什么的都不知道，呜呜呜。。。
  在此谢谢大家谢谢大家谢谢大家了！！！

• 圆圆圈圈 (2013-12-17 11:25:54)

  
  你透析脱盐用的是什么缓冲液，也是PB吗？你用的PB是多少mM的？有没有试过10mM或者20mM的PB。另外，你透析完后样品电导有多少？
  你想知道CM有没有挂东西，你只要上完样后，直接用100％的B洗脱就知道了。
  还有就是你的洗脱液B应该用1M的NaCl比较好，0.4的如果蛋白吸附太牢固是洗脱不下来的。
  最后，建议你把每个峰都收集起来，测抑菌圈。
  
  从你的结果看，CM和SP都没明显的锋，有可能你的蛋白是酸性蛋白。DEAE有3个峰，你应该测下抑菌圈

• yjf1026 (2013-12-17 11:26:12)

  
  抗菌肽一般带正电荷，分子量都比较小，要不楼主直接走反相吧，应该对活性影响不大的

• 杨过爱大米 (2013-12-17 11:26:40)

  
  大家好！
  我是用去离子水透析的，没用缓冲液，我上柱的缓冲液是20mM的PB，透析完后的样品电导是5.4ms/cm。不知道这个电导对于上离子柱是不是太大了？

• 圆圆圈圈 (2013-12-17 11:26:59)

  直接在这里回复你吧
  5.4的电导我个人觉得是有点高，但具体还是要看你的蛋白是不是能挂住。
  你透析的时候应该用你后面接着的离子交换的平衡缓冲液进行透析，这样才能保证你的样品所处的pH、离子强度等环境和你离子交换的环境一致