【求助】Ni-IMAC亲和预装柱过了保质期......

最新回复

• NBA (2013-12-18 17:22:02)

  不一定时柱子的问题，也有可能时你的包涵体没打开或者标签丢失了，可以做个WB看看。你看看柱子的颜色是不是明显的蓝色，正常的是浅蓝色，那样柱子一般都没问题。或者你把它再生一下，看能不能挂上Ni，能挂上就没问题

• 小鱼鱼 (2013-12-18 17:22:24)

  Bio-Rad的预装柱是看不见基质的！

• 小鱼鱼 (2013-12-18 17:22:44)

  
  还有我的包涵体之前能用这个柱子纯下过东西！但是这次就是不行！我用的菌是28a.一般不容易丢失的！

• NBA (2013-12-18 17:23:19)

  
  那你可以先做WB确定是否有标签，然后按EDTA、NaOH、NiSO4的顺序再生一下柱子，再挂一次看看。柱子保存好的话一般不会过期，我们实验室的柱子超高的使用频率，用两三年载量都不会有明显下降

• 小鱼鱼 (2013-12-18 17:23:43)

  
  如果做WB的话，那要6×His-tag 抗体吧? 但是，之前，我对同一个菌，同一个蛋白都能挂上的！现在只是想做下柱上复性！今年来就一直挂不上！我的cartridge是从5×1 ml 的Kit上 哪出来的，之前都一直保存在4℃。20%乙醇。

• NBA (2013-12-18 17:24:08)

  对，就是抗His。还有，你的buffer上有什么成分？如果有DTT或者巯基乙醇就肯定挂不上Ni柱

• 小鱼鱼 (2013-12-18 17:24:28)

  
  但是！我的溶解buffer的确含有1mM的2-ME，但是，我是看过操作手册的！操作手册上说，她能兼容20mM的2-ME，而且，我知道bio-rad的预装柱是IDA基质的，所以不能用DTT。我是按照说明来的，应该不会有错的。另外，我的蛋白上有3对二硫键，所以不用还原剂是不可能溶解。请问有什么还原剂能取代2-ME。还有，我知道GE的1ml的Hitrap预装柱是能兼容30mM的2-ME和10mM的DTT的。我的配方也是按照GE公司的操作手册上来的。只是把体系改成了KH2PO4缓冲体系，这个是bio-rad的操作手册上的推荐的缓冲体系。还有，GE用的还原剂时DTE，难倒DTE的对柱子的损害程度要小？
  急切知道答案！谢谢各位前辈！

• NBA (2013-12-18 17:24:49)

  
  可以把你的溶解buffer配方写一下吗？既然是包涵体，二硫键就可能折叠不正确，即使是有二硫键，1mM 2-ME 也没什么用。有试过不用2-ME吗？直接用6M 盐酸胍

• NBA (2013-12-18 17:25:07)

  
  还有，GE的柱子绝对不能加DTT，即使是痕量也会使柱子整个还原变色。而且，IDA比NTA更加不能耐受还原剂，所以最好不要用。

• 小鱼鱼 (2013-12-18 17:25:26)

  
  我觉得你先别急。
  把菌、破碎上清、破碎沉淀、沉淀脲溶解分别跑page胶看一下，确定你的蛋白能被脲很好的溶解变性。如果脲溶的很好，再考虑为何不挂柱。
  检查你的binding buffer和上柱样品中别加咪唑试试。
  另外，GE的Ni柱耐受5mM 2-ME是没问题的。