【求助0】蛋白不表达

最新回复

• xingyi08 (2013-12-18 17:40:12)

  
  先看看构建的质粒有没有问题嘛。

• 30moonriver (2013-12-18 17:40:35)

  
  在诱导之前抽过质粒，PCR检测有目的条带，但是未见目的蛋白表达

• wmp1234 (2013-12-18 17:40:58)

  
  质粒有没有经过酶切验证和测序验证

• cwcwcww (2013-12-18 17:41:18)

  
  可以从一下几个方面去总结分析一下：
  1：确认你的目的片段成功插入至表达载体中，而且其插入顺序没有问题，不存在突变，是否包含有完整的启动子或是终止子序列。而且确认转入至合适的表达宿主。
  2：成功构建表达元件后进行诱导表达的实验，在没有成熟的诱导表达体系之前都需要自己去摸索：诱导剂的浓度，诱导时间，诱导温度等等。同时注意实验操作过程的小问题，比如抗性的选择等等。。。
  3：产物的收集和浓缩。在检测目的蛋白是否表达首先要分析产物是在胞外还是胞内，目的蛋白的特性等等，以免在浓缩之前目的蛋白受到损失或破坏。
  4：运用多种检测方法的检测。每种检测方法的灵妙度不同，具体的蛋白检测方法根据实验室或是个人需求选择。终极目标就是准确就好。
  。。。。
  认真分析总会有结果的，祝实验顺利！

• 30moonriver (2013-12-18 17:41:42)

  补充一下，用特异性引物从cDNA中PCR获得目的片段，TA克隆后，PCR能检测到明显的目的条带
  质粒经bglII和EcorI酶切后获得具有粘性末端的目的片段，用BamHI和EcorI双酶切PGEX-3X，其中BamHI和bglII是同尾酶，连接转化后，奇怪的是，获得的质粒的PCR结果中除了明显的目的条带之外，在其上方还有一条同样很明显的条带，（不知道是不是发生了突变？）
  将空质粒做了PCR，但并未检测到任何条带，因为目的条带比较明显，所以试着往下做，但SDS-PAGE检测结果并没有看到明显的目的条带
  诱导后的菌液经离心后，加入水和loading buffer煮沸5-10min，直接电泳检测，这样做有问题吗？
  正在尝试改变诱导时间、温度和浓度等实验条件，由于问题比较多，是不是需要重新从头开始做？希望各位前辈提出宝贵的意见！谢谢

• yjf1026 (2013-12-18 17:42:10)

  质粒有没有经过酶切验证和测序验证
  
  ================================================
  
  一定要做酶切和测序验证的，电泳又看不出来有没有突变。

• cwcwcww (2013-12-18 17:42:32)

  
  可能问题：
  1：如以上战友提到的，你的序列最好经过测序验证（完整测通的），避免因PCR引进突变（毕竟再保真的酶都有错配的可能）。
  2：进行PCR验证的时候，对于同一模板而言的话，有突变基本不影响片段大小的。所以楼主当中的非特异扩增在验证不是质粒部分后，就有可能是你的模板出现问题，特别对于质粒抽提当中的基因组的少量污染。当然这些都要保证你的其他体系没有问题（来个不加模板的阴性对照）。
  3：诱导的东西先不说，在你收集菌体后的处理方式，楼主可以考虑进行5M的尿素和loading buffer煮沸10分钟的方式，确保目的蛋白的释放，此方供参考。
  4：确认问题后楼主就知道试验还有没有重复的必要了。。。
  记住，实验就是重复加不断的重复，而又不是无谓的重复！
  祝你好运！

• ffaa (2013-12-18 17:42:52)

  
  请教：抗菌肽能用E.coli表达？产生的抗菌肽不会对你的BL21的生长产生抑制？

• 30moonriver (2013-12-18 17:43:09)

  
  我用的表达载体是pgex-3x，载体上的GST连着目的蛋白，影响其空间构象，可以消除对细菌生长的抑制。

• greenbee (2013-12-18 17:43:33)

  
  GST一般不会影响折叠的。可以尝试18C过夜表达，还可以试一下加1％葡萄糖，IPTG 0.4mM足够了，还有种子液的浓度，诱导时的OD值都应该注意