【求助】求助蛋白纯化的问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-12-19 10:59 作者: Ao7 来源: 分析测试百科网

我用的PGEX载体目的蛋白GST-Target 36KD
表达菌株是Rosetta gami 2。 30度诱导五小时 GST柱子纯化
发现纯化后是两条带。有26KD左右的带而且量大于目的蛋白的带。开始怀疑是空载体污染，可是经过酶切发现没有质粒污染。
包涵体纯化发现有微弱目的蛋白，好像没有26KD的条带。请给点建议，如何让我纯化出目的的36KD的条带啊？

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【求助】求助蛋白纯化的问题

37167325.jpg

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最新回复

fei1226com (2013-12-19 10:59:31)

没看明白你的图，可再详细说明一下。
Ao7 (2013-12-19 11:00:06)

QUOTE:
原帖由 fei1226com 于 2013-12-19 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

没看明白你的图，可再详细说明一下。
我诱导融合蛋白表达，为什么GST也会表达很多呢？？？质粒是纯的，是融合质粒

28115196.jpg
yonger (2013-12-19 11:00:27)

你这个是SDS的图吧？marker的分子量都是多少？
GST和你的目的蛋白分开了？你切开了？
Ao7 (2013-12-19 11:01:11)

QUOTE:
原帖由 yonger 于 2013-12-19 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

你这个是SDS的图吧？marker的分子量都是多少？
GST和你的目的蛋白分开了？你切开了？
我的目的蛋白是GST融合蛋白，按理只能诱导出这一个。可是发现还混有GST啊，奇怪。
yonger (2013-12-19 11:02:53)

QUOTE:
原帖由 Ao7 于 2013-12-19 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

我的目的蛋白是GST融合蛋白，按理只能诱导出这一个。可是发现还混有GST啊，奇怪。
还是没听懂...你的GST是在目的蛋白的N端还是C端，“只诱导出一个”是什么意思？你认为下面那条带是单纯的GST蛋白？你这是SDS的图吧，怎么判断是什么蛋白？
PINK (2013-12-19 11:03:41)

你的图片上没有标上marker，大家看不大懂。
GST诱导表达的蛋白有时候是有断裂的现象，请看前不久大家讨论过的一个帖子：
[精华] 【专题讨论】^^^^^不同的目的蛋白在pGEX上表达纯化后，均遇到了一条杂带，看着很诡异（附图）^^^^^
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15312605&sty=1&tpg=2&age=-1')
eve_49 (2013-12-19 11:21:16)

就是啊，关键是你怎么确定下面的条带是GST带而不是降解的蛋白带？有没有做一个孔载体的表达对照啊？
pengke1983 (2013-12-19 11:21:45)

我觉得有2种可能：
1.表达菌种被含有空载体的菌种污染了，可能性比较大。
2.蛋白在最后一步洗脱的过程中被切掉了GST标签，可能性比较小。
Ao7 (2013-12-19 11:22:14)

就是啊，关键是你怎么确定下面的条带是GST带而不是降解的蛋白带？有没有做一个孔载体的表达对照啊？

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我的目的蛋白大约36KD GST大约26KD。据说断裂可能会断裂N端得10KD
我的目的蛋白如果断裂，可能产生的片段和空GST相似无法区分啊
Ao7 (2013-12-19 11:23:18)

我觉得有2种可能：
1.表达菌种被含有空载体的菌种污染了，可能性比较大。
2.蛋白在最后一步洗脱的过程中被切掉了GST标签，可能性比较小。

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我摇菌提质粒酶切，发现没有杂菌（特别是空载体污染啊）。如果断裂的话为什么我上清里纯化的大部分是断裂的，而包含体中断裂的少
wmp1234 (2013-12-19 11:23:40)

贴上诱导前和诱导后、破菌后、纯化前的电泳照片对照，看看是表达时断裂还是纯化过程断裂，然后再找相应的对策。
Ao7 (2013-12-19 11:24:23)

QUOTE:
原帖由 wmp1234 于 2013-12-19 11:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

贴上诱导前和诱导后、破菌后、纯化前的电泳照片对照，看看是表达时断裂还是纯化过程断裂，然后再找相应的对策。
全菌的电泳图没有保存，但是上面也有26KD的条带，量也挺大
谢谢啊
wmp1234 (2013-12-19 11:24:52)

QUOTE:
原帖由 Ao7 于 2013-12-19 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

全菌的电泳图没有保存，但是上面也有26KD的条带，量也挺大
谢谢啊
36kd目标蛋白与26kd的比例和你纯化后的一样吗？
如果表达就是36kd目标蛋白这么少的话，我想你应该考虑换表达载体或者优化表达条件的。
Ao7 (2013-12-19 11:25:22)

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原帖由 wmp1234 于 2013-12-19 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

36kd目标蛋白与26kd的比例和你纯化后的一样吗？
如果表达就是36kd目标蛋白这么少的话，我想你应该考虑换表达载体或者优化表达条件的。
对呀表达量很少，目前想增加诱导时间。Rosetta gami 2菌表达量不是太高，用BL21诱导不出来
avi317 (2013-12-19 11:26:12)

我提的几个GST蛋白都会在25kD处有条带,猜测是不是有一部分表达到25kD那里终止了.不过我的过一个分子筛就纯化干净了,你的两条带离得太近了。
如果真的很在乎纯度的话，用his tag就不会有这种情况了。建议换载体
BOSS2011 (2013-12-19 11:26:41)

象是内源蛋白酶将你的融合蛋白切了。。。
xue258 (2013-12-19 11:27:03)

可能是你菌体破碎的条件不好，超声的强度过大或时间过长，导致GST标签断裂
duoduo (2013-12-19 11:31:02)

QUOTE:
原帖由 xue258 于 2013-12-19 11:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
可能是你菌体破碎的条件不好，超声的强度过大或时间过长，导致GST标签断裂
我没用超声破碎，是用的SDS上样缓冲液变性的。
我只是想知道，如果在现有载体和表达质粒的情况下，能提高表达量，并有效分离出这两条蛋白吗？？
831226 (2013-12-19 11:32:07)

我前一段时间跟你跑的结果一样，也是每次跑完后在GST标签处会有大量的标签蛋白表达，后来我又改变了一下诱导条件，低温诱导，20度诱导12个小时，再跑SDS-PAGE，结果就非常好了，你也可以试一下。