【求助】超滤损失问题

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• gogo (2013-12-19 15:05:08)

  
  有个提高回收率的小办法，就是将浓缩液回收后，用少量BUFFER放到超滤器里面，让其继续循环一个流程，再回收一次，里面会有不少蛋白

• glass (2013-12-19 15:05:31)

  
  本人认为用的超滤管的孔径大了些，一般相差10倍以上才能很好的潴留。

• 龙小好汉 (2013-12-19 15:05:58)

  QUOTE:

  原帖由 gogo 于 2013-12-19 15:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  有个提高回收率的小办法，就是将浓缩液回收后，用少量BUFFER放到超滤器里面，让其继续循环一个流程，再回收一次，里面会有不少蛋白

  
  请问循环一个流程具体是多久？我每次做完是都有先用空气把里面的都顶出来，然后再用几百毫升的缓冲液顶洗的，最后再把这些跟原浓缩液混在一起取样的，损失还是那么大。

• 龙小好汉 (2013-12-19 15:06:14)

  QUOTE:

  原帖由 glass 于 2013-12-19 15:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  本人认为用的超滤管的孔径大了些，一般相差10倍以上才能很好的潴留。

  是有考虑过用3KDa的，不过怕到时速度过慢，时间过长反而会影响蛋白活性。我用的是PALL超滤器，他们给的资料是3~6倍。

• mamamiya (2013-12-19 15:06:46)

  QUOTE:

  原帖由 龙小好汉 于 2013-12-19 15:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  请问循环一个流程具体是多久？我每次做完是都有先用空气把里面的都顶出来，然后再用几百毫升的缓冲液顶洗的，最后再把这些跟原浓缩液混在一起取样的，损失还是那么大。 ...

  一般加10～50ml缓冲液，不断循环30min以上～60min，我们用PALL的回收率上90%没有太大问题
  

• 龙小好汉 (2013-12-19 15:07:05)

  对于一般蛋白，楼主选择的孔径没有问题，如果是进口的切向流，4倍分子量以上即可取得很好的回收率。如果是吸附，可以选择低吸附的膜质材料，millipore、pore和sartorius均有号称低蛋白吸附的膜产品，但具体效果如何还需要小试筛选。超滤完蛋白回收对总收率也有很大影响，注意尽量不要产生泡沫。总的来说首先找到损失在哪里吧，是在滤过液里面，还是被膜吸附。

• 龙小好汉 (2013-12-19 15:07:27)

  我这没法实现连续自动加缓冲液，只能超滤到一定的体积后再加入缓冲液，这样就有个要不要摇匀的问题：不摇匀怕影响超滤；摇匀了又容易产生泡沫？还有除菌过滤过程中也很容易产生泡沫，有没有什么办法可以尽量避免?谢谢

• 龙小好汉 (2013-12-19 15:07:49)

  刚又去查了下，以前测过三次滤过液里的蛋白含量，HPLC做出来约28%，超滤总损失40%。这样是不是膜孔径太大了？怎么看战友们的回收率都有90%

• xingyi08 (2013-12-19 15:08:14)

  刚有去查了下，以前测过三次滤过液里的蛋白含量，HPLC做出来约28%，超滤总损失40%。这样是不是膜孔径太大了？怎么看战友们的回收率都有90%

• hold住 (2013-12-19 15:08:41)

  
  主要用于脱盐浓缩和置换缓冲体系
  说实话，超滤用来浓缩还可以，置换缓冲液的效果不怎么样！建议用离子交换柱浓缩，然后脱盐柱脱盐并置换缓冲液，效率会高些

• JK.jon (2013-12-19 15:09:01)

  先要分析一下损失的原因是什么，损失的是活性还是蛋白。
  1、活性损失，可能与操作过程有关，例如浓度，pH，环境温度，降解等。
  2、蛋白损失（下同），超滤形成沉淀，或原液中就有沉淀。这是较常见的现象。从你的描述看，出口液流速慢慢减小，如果不是因为溶液粘度的原因，那应该是有细微的沉淀。超滤前用0.22um过滤后再超滤。如果是超滤过程中产生沉淀，那就要调整超滤工艺了，例如调节原液的pH，补充缓冲液的组成等。
  3、滤过液里的蛋白含量，HPLC做出来约28%。这是很不正常的。如果HPLC没有做错，那么应该是膜有问题。不是因为膜孔径的问题，5kd膜超滤27kd的目标蛋白应该完全没有问题，5kd膜超滤8-10kd蛋白我都经常做的。而是膜有可能穿了。最好换块新膜看看。
  4、用其它方法来浓缩确实是个好主意。如果超滤的体积不是非常大，例如在10L以下，可以考虑离子交换、亲和、疏水等其它吸附类的层析方法浓缩，往往效率很高。洗脱后透析或G25换液。
  5、加液摇匀必要性不大。因为大板式超滤的回流冲击可以完成混匀的目的了，小规模的超滤一般可以在容器中用慢速的磁力搅拌。

• 龙小好汉 (2013-12-19 15:09:26)

  
  谢谢上面的两位战友。
  做的是5KDa超滤前后两次的蛋白含量（Lowrry法），差别就有这么大，应该只是蛋白的损失。另外在5KD超滤过程中出口液流速慢慢减小到一定流速，有没有可能是极化现象产生了凝胶层导致滤膜的通量下降？
  有换了新膜了，效果还是一样。不过因为目的蛋白有单聚体是13.5KD的，只是不稳定，一般以二聚体27KD存在的，会不会是这个原因？如果是的话要怎么选膜包？3KDa合适吗？
  因为目前很难更换设备或改变工艺了，只能从目前条件找找原因，来提高得率了。

• JK.jon (2013-12-19 15:09:56)

  既然你们做蛋白，那肯定有冻干设备了，脱盐柱置换缓冲液后冻干浓缩，这样很简单的

• cwcwcww (2013-12-19 15:11:01)

  
  你在前一个帖子中说HPLC测滤过液的目的蛋白含量28%，后一个帖子说，是用lowry法测定超滤前后的蛋白浓度，计算出蛋白损失的。我看不明白了。
  HPLC测滤过液的目的蛋白含量28%就是一个很难理解的表述。是HPLC测定的峰面积比值？那么它表征的是一个纯度指标。说明还有72%的其它物质，也就是讲你的超滤前样品溶液并没有纯化好。
  按理说，纯化工艺最后一步的超滤应该只是用来浓缩和换液，样品应该已经是高纯度的了。你为什么HPLC滤过液会有28%这个数值？
  lowry法定量也有可能是你计算出损失的原因。看看超滤前的溶液体系中有没有lowry法干扰的物质，例如一些小分子的东东，lowry法有测定值，但不是蛋白，超滤透出了。就是说这个蛋白损失是个假象，损失的其实不是目标蛋白。
  我觉得最好的方法是检查超滤透出液，做电泳，做WB，做活性检测，看看是不是真的有目标蛋白超滤透出。还有，看看超滤前后样品的总活性和比活性是如何变化的。可以间接证明可能损失的并不是目标蛋白。

• 龙小好汉 (2013-12-19 15:12:00)

  滤出液因为蛋白含量太低，lowry法测不出来，后来只好用HPLC，28%是滤出液峰面积跟超滤液目标蛋白峰面积的比较得出的。我没说清楚，不好意思。
  现在有在尝试做一些检测了，多谢上面的战友们。

• ritou1985 (2013-12-19 15:13:02)

  
  如果是滤出溶液中大量损失了目标蛋白，而换了新膜也没有改进的话。我怀疑你们装膜有没有问题啊，每次使用前都通过完整性测试了么？
  我采用的切向流都是连续加样，通过加液泵，搅拌器很容易实现的。超滤中及时搅拌也很重要，否则浓度不均用对超滤效果也有影响。搅拌不宜剧烈，以免带入空气。
  还有我个人觉得切向流超滤不管在置换缓冲液和浓缩方面使用还是很方便的，很容易控制热原，而且过程简单，适合大规模生产，得率一般来讲都能控制到90%甚至95%以上。
  你的蛋白有以二聚体存在，超滤会不会破坏啊。检测一下滤除液中是单体还是二聚体。