【求助】Western blotting问题求助

最新回复

• kuaizige (2013-12-20 14:48:15)

  santa cruz公司的抗体质量很不好，估计最大的问题就是一抗。
  对于你提的几个问题，你的方法是对的，不会影响结果。

• kuohao17 (2013-12-20 14:48:33)

  
  试试封闭1.5hr， 一抗孵育过夜。

• jkobn (2013-12-20 14:50:47)

  QUOTE:

  原帖由 yapuyapu 于 2013-12-20 14:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  近两天,连b-actin都做不出来了,将步骤写出来,望高人给予指教.
  电泳:上样蛋白总量50ug,考染蛋白条带清晰.
  转印:在硝酸纤维素膜上可见清晰的预染Marker条带
  封闭:5%脱脂奶粉,4度封闭过夜(注:5%脱脂奶粉用TBST配制)
  1:2 ...

  你是考染过后，用同一块胶转的膜吗？如果是这样的话你做不出来就对了，考染过后蛋白被固定在胶上，是转不过去的。
  5%脱脂奶粉封闭液是TBST配置的。
  Tween-20浓度是0.1%。
  你其他的步骤我认为应该能做出来。
  再试试，或换抗体试试，祝你成功！

• yapuyapu (2013-12-20 14:53:23)

  我跑两块同样的胶，一块胶考染，一块胶转膜。
  我有一个问题想问一下：你稀释一抗和二抗的时候，用的是TBST还是TBS呢？

• yapuyapu (2013-12-20 14:53:43)

  QUOTE:

  原帖由 jkobn 于 2013-12-20 14:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  你是考染过后，用同一块胶转的膜吗？如果是这样的话你做不出来就对了，考染过后蛋白被固定在胶上，是转不过去的。
  5%脱脂奶粉封闭液是TBST配置的。
  Tween-20浓度是0.1%。
  你其他的步骤我认为应该能做出来。
  再试试，或换抗体 ...

  1 上样量太大，抗原过多
  2 一抗质量有问题，现在我又重新定了新的抗体
  再接再励，希望下次能做出来。

• taoshengyijiu (2013-12-20 14:54:58)

  我觉得需要排除：
  1.发光显影定影是否有问题
  2.二抗是否有问题（种属、二抗和发光液能发发光）
  3.一抗是否有问题（个人觉得ACTIN抗体应该不至于不行）

• avi317 (2013-12-20 14:55:35)

  
  应该是一抗的问题，试下四度摇床过夜吧，好运！

• yapuyapu (2013-12-20 14:58:05)

  昨天我又重新换了新的一抗,今天显影,结果还没出来.我们这儿没有四度摇床过夜的条件,我把它放在四度冰箱,可以吗?

• flower-201 (2013-12-20 14:58:27)

  
  直接放四度冰箱应该是可以，我曾经这样做过！
  换一下发光剂试试吧！

• zhenxin (2013-12-20 15:00:30)

  
  做个阳性对照？？

• qianqin1977 (2013-12-20 15:00:49)

  其实western的每个步骤都可能出问题，建议刚开始的时候和别人一起做，比如用别人已经做出来过的actin抗体、二抗、发光剂等，做出内参条带后可以知道整个操作是没有问题，就可以继续排查其他原因了。如果一上来就自己摸索，那么影响因素太多，很难一下子就找到。

• qianqin1977 (2013-12-20 15:01:07)

  
  最主要的几个环节是：蛋白质是否降解？一抗、二抗是否合适？发光剂是否有效？其他方面影响倒不是很大。

• yapuyapu (2013-12-20 15:01:32)

  我有两个问题想要请教一下:
  第一个:转移缓冲液到底该用哪个配方好呢?是Tris-base 5.8g 甘氨酸 2.9g 甲醇 200ml SDS 0.37g呢还是甘氨酸 3g Tris 14.4g SDS 1g 甲醇 200ml 加蒸馏水至 1000ml呢?
  第二个:TBST中加0.1%的Tween-20呢还是0.05%的Tween-20呢?

• flower-201 (2013-12-20 15:01:54)

  
  我通常是用10*的电泳缓冲液100ml，加去离子水至500ml，再加入200ml甲醇，最后补去离子水至1000ml即可。（湿转）
  转印时要注意电压和电流，电压控制在85v以内，电流控制在330mA以内，以免过热。
  TBST中加的是0.1%的Tween-20。
  一抗通常4度摇床过夜，二抗通常4度1h（可根据抗体而定）
  洗膜时是TBST洗两次各10min，然后用TBS洗一次10min。
  结果一直很稳定，条带也很漂亮。
  希望对你有所帮助。祝成功！

• shenkunjie (2013-12-20 15:03:03)

  上面说了这么多，我感觉你不是新手，不应该出现那些问题。
  个人感觉你的问题是：ECL显色剂过期了，或者定、显影液过期了？

• yapuyapu (2013-12-20 15:04:56)

  谢谢flower-201的热心回复,那你的转印缓冲液配方应该是Tris碱 3g,甘氨酸 14.4g,甲醇 200ml
  最后定容至1000ml?不加SDS吗?为什么呢?
  我现在做的目的蛋白是beta-actin,用的电流是200mA 电压是100v,恒流转1h,你认为我的转印条件如何呢?
  不过,我用的转印缓冲液配方是Tris-base 5.8g 甘氨酸 2.9g 甲醇 200ml SDS 0.37g,转印完之后,胶染色没有条带，但膜经丽春红染色后条带比较模糊.我这种情况是否正常呢?谢谢了

• flower-201 (2013-12-20 15:05:16)

  
  感觉你的转印条件有些奇怪，因为我们的缓冲液通常在85V的时候电流就能达到300mA，所以不清楚你为何能维持在200mA，100V的条件。个人感觉你的条件电压偏高而电流偏低。
  不过转印条件的变化也不一定导致阴性结果啊，关于丽春红染色，我极少做的，因为看到marker的转移效果就可判断了。
  建议你还是看别人做一次，或跟着别人做一次，有过成功的经验就知道哪些环节可能出问题了。