【求助】我的载体只表达出GST标签蛋白！

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-12-20 16:04 作者: rxcc33 来源: 分析测试百科网

最近做表达，把1300bp构建到pGEX-4T-1中，invitrogen公司测序结果没有问题，密码子没有移位，在Rosseta（DE3）表达，拿空载体也一起表达，表达时间3小时、7小时，跑胶做western blotting，结果发现我的载体只表达出GST标签蛋白

查看完整版本请点击这里：
【求助】我的载体只表达出GST标签蛋白！

我也来说两句查看全部回复

最新回复

rxcc33 (2013-12-20 16:04:49)

我的western 图片，有标注，到底什么原因？求助

18307894.jpg
lxh031 (2013-12-20 16:05:13)

1300bp的GST-fusion 不会很有效的被表达可能你的蛋白已经表达但是效率很低你需要改善induction的条件试试低温度长时间
收集uninduced 和induced 样本
并在induction过程每隔一小时收集样本
如果induction没问题用多一些量的GST-fusion蛋白做WB （可能你的表达效率很低）
你可以用SDS-PAGE取代WB 简单一些但是sensitive amount在100ng 左右
比WB不敏感
1300bp的GST-fusion 不会很有效的被表达可能你的蛋白已经表达但是效率很低你需要改善induction的条件试试低温度长时间
欢迎继续交流
rxcc33 (2013-12-20 16:07:49)

相关疾病：
头痛
WB是一点都看不到目的条带啊，所以可能就不是表达量很低的原因了，我改了一次诱导的条件，iptg 0.1mm、25℃诱导了3、6、9小时，只能看到表达的GST标签蛋白，就是丝毫看不见70kd的蛋白，疯了都
注：测序结果正确，无终止密码子，无移位，酶切分析了，条带正确，所以很是头痛。
hold住 (2013-12-20 16:08:07)

理论上来讲，你是遇到鬼了。
现在最快最简便的方法是从新构建一个表达质粒，这比找原因快多了。
构建表达质粒简单也复杂，简单来说，就几个步骤，用个小树枝在地上画画就明白了。所以重新操作一点也不费事。
复杂来讲，现在谁能确切地说清楚基因表达过程，有哪些因子参与了？确切过程怎么样的？所以就不要费心找原因了。
rxcc33 (2013-12-20 16:08:31)

我看重新构建载体就不必了，因为载体测过序列没有问题的，所以问题肯定出在表达上面了
难道闹鬼了？
lxh031 (2013-12-20 16:08:59)

看到说也有可能是菌株不纯，带空质粒和重组质粒的菌混合了，结果在大量培养的时候，空质粒菌株生长占优势。
划线培养，挑克隆试试看。
rxcc33 (2013-12-20 16:09:23)

考虑到操作过程中的可能性，觉得污染可能性太小了，不太可能，干脆换载体
lxh031 (2013-12-20 16:09:43)

换载体不错不错。
那么换不换Tag标签？GST 有两个很大的作用，1是有利于亲和纯化，2是增加易形成包涵体蛋白质的可溶性表达。如果换标签会不会带来新的问题？