【求助】RIPA裂解液制备的细胞蛋白样品，如何处理后....

最新回复

• fqswdzd (2013-12-20 21:59:39)

  
  超滤，用2D的裂解液替换RIPA

• daod (2013-12-20 22:00:00)

  QUOTE:

  原帖由 fqswdzd 于 2013-12-20 21:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  超滤，用2D的裂解液替换RIPA

  能再具体一点吗？
  超滤的大体步骤，还有用什么材料？处理1ug的蛋白要多少经费啊？多谢啦。

• guagua (2013-12-20 22:00:31)

  超滤会损失很多一定阈值下的蛋白啊，这方法不好吧

• guagua (2013-12-20 22:00:52)

  我上次没解决这问题。不过个人思路是避开盐和SDS的影响，这是影响IEF的两大因素。
  你可以用预冷有机试剂去直接沉淀溶液（有机溶剂在最后的总体积比例最好大于90%，具体原理在生化三版可以看到)，例如丙酮，复洗的最后两次用80%的丙酮（水稀释）。然后换用常用的裂解液，复溶，超声，定量，上样。
  这方法我没经过验证，但是我觉得非常可行。

• daod (2013-12-20 22:01:12)

  
  下面这个贴子: 【专题讨论】2D PAGE 实例分析（2D Troubleshooting) 第二波： 从样本制备到结果分析 [精华]
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=12245427&sty=1&tpg=1&ppg=1&age=0&ticket=ST-2269618-iXO0wzwAzkJgMei7z1dPFa5BKEbxyoiwaEW-20')
  第十楼 solonye战友说“中图展现的是将幼虫匀浆以后使用2%的SDS裂解， 并且随后在95°下加热3分钟处理得到的图谱。 虽然有SDS的存在， 但是2D的展现很好， 点分离清楚， 并且在垂直的分子量水平上和水平的等电点上都得到了很好的展现。”
  难道含有SDS的裂解液所制备的蛋白样品也能够很好地等电聚焦吗？

• guagua (2013-12-20 22:01:35)

  
  SDS影响没那么严重（但不代表它不影响），它是很好的变性剂，2%这个浓度的SDS裂解液我也用过。我估计你的问题主要是盐产生。盐的阈值我忘记了，但是肯定要远远小于150mmol/L的NaCL。

• daod (2013-12-20 22:01:53)

  
  这种裂解液的成分是50mM Tris (pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin
  看来是Nacl的原因了

• daod (2013-12-20 22:02:25)

  依您的经验，我下一步该怎么处理？
  使用2D-clean up还是用SDS removal kit?
  或者用TCA-丙酮沉淀？
  多谢啦

• sunnyB (2013-12-20 22:03:24)

  
  1.最好是重新取样
  2.透析---冻干----换裂解液重溶
  3.超滤，现在公司一般都推荐超滤
  4.2D-clean up师兄用过，不过样品的损失也很大。SDS removal kit没用过,sigh~~~
  5.TCA-丙酮，并不太适合用于除盐，且得率不是很高，我在做预实验时一般用这个方法，省钱省时

• guagua (2013-12-20 22:03:46)

  
  这个我觉得有几个方法都可以：
  首选还是我刚才所说的，用80-90%的冰丙酮去洗涤（不是TCA-丙酮沉淀），这个浓度的比例，蛋白质大部分还是保持不溶状态，而盐会洗去一部分，具体的化学原理不太记得了，水平有限。
  其次是透析，这个主要是因为很费时间，方法肯定是好方法，最好的除盐方法。根据你的操作，这个方案和你刚才那个方法的蛋白损失程度应该差不多。
  2D-clean-up也可以，这方法的缺点是会在2D上损失一些点，会损失点，但是图也是可以接受的，你要觉得挑选方法太麻烦，那就按这方法做。2D clean up，然后蛋白复溶在普通Lysis Buffer里。
  最后是超滤，其实还是觉得不是什么好方法，会损失掉阈值以上的蛋白质，而且很容易堵住膜。相信现在用切向流超滤的人很少很少。
  这就是我的建议