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【求助】DEAE sepharose FF纯化
【求助】DEAE sepharose FF纯化
我要纯化一种血浆蛋白，等电点4.5左右，样品的电导5.0左右，用得缓冲体系pH6.5，可是蛋白却吸附不到DEAE Sepharose FF柱子上，有哪些原因呢？恳请各位朋友帮忙!
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-12-21 16:22 作者: 969 来源: 分析测试百科网
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xiaoxiaoniao (2013-12-21 16:22:47)
969 (2013-12-21 16:23:08)
QUOTE:
你好！用tirs好呢还是PB好呢？我用tris做了pH6、7、8的梯度，吸附量都只有30%--40%，怎么回事呢？qqq111 (2013-12-21 16:23:31)
血浆蛋白有可能是糖蛋白，糖链的不均匀性会造成表观等电点弥散。所以可能你的蛋白理论等电点为4.5，但实际上是一个分布。
你的样品电导偏高了，一般做离子交换柱，样品和平衡缓冲液的电导要控制在小于3，除非你已经摸索出来了确定的工艺。
PB和Tris我觉得都可以用，这应该不是造成你的样品吸附量少的原因。
你做pH梯度pH6、7、8的试验时，样品也调节到同样的pH吗？平衡缓冲液调节pH后有没有注意电导是否过高？
血浆的成分比较杂，有些小分子的物质对离子交换有干扰。所以通常用的离子交换柱要比估算的大一些，甚至大几倍，才能保证对目标蛋白的吸附。
另外，血浆中白蛋白、IgG的含量很高，做DEAE柱纯化可能会吸附减少柱容量。方便的话，可以先将血浆中这些高丰度的蛋白去除，也是一个纯化的思路，例如硫酸铵沉淀。
969 (2013-12-21 16:24:08)
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你好！我分别用的20mM tris和20mM的PB，电导在1.5以下，样品的pH的也都相应的调了，调了之后电导也没什么问题，在2以下。我用的原料不是血浆，是生产血液制品过程中的组分沉淀，我先把沉沉用buffer抽提，那然后分离，其中白蛋白含量不多。另外，该蛋白是糖蛋白，你所说的等电点弥散，那应该怎么解决？
windy+++ (2013-12-21 16:24:39)
先做盐析沉淀，再做DEAE
fox_79 (2013-12-21 16:25:34)
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20mM的PB，电导是比1.5大吧。你用的什么仪器做纯化，是AKTA吗？
沉淀用平衡buffer溶解后，最好对平衡缓冲液透析一下，以保证和平衡体系相同，出问题时可以排除样品体系的原因。
等电点弥散没有什么解决办法，无非就是提高pH，加强吸附。或者换另一种纯化方法。
969 (2013-12-21 16:27:10)
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我这个是公司合作项目，将来是要生产的，盐析这条路就走不通了
969 (2013-12-21 16:28:23)
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沉淀用平衡buffer溶解后，最好对平衡缓冲液透析一下，以保证和平衡体系相同，出问题时可以排除样品体系的原因。
我用的是AKTA ，explorer100.的样品抽提过后电导比缓冲液高0.5左右，一定要透析吗？差这么少也要透析？
969 (2013-12-21 16:30:07)
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不光是电导的原因。是冷乙醇沉淀的样品？或许其它物质会有干扰，透析最保险。
969 (2013-12-21 16:31:15)
QUOTE:
对，是低温乙醇沉淀产生的样品，我明天透析看看效果33号 (2013-12-21 16:31:53)
buffer 抽提？
是把沉淀给放到布什漏斗上抽滤？得到溶液 以祛除助滤剂？
如果目标是igg 的话 建议你可以进行一下巴氏灭活 祛除杂蛋白。
60度 igg能抗得住这温度的
如目标是 凝血因子类产品，情况就比较复杂了。具体问题具体分析吧
969 (2013-12-21 16:32:19)
QUOTE:
是，取沉淀，然后用buffer4度搅拌5h，然后离心取上清，不要IgG，也不是凝血因子，是一种抗凝蛋白INK (2013-12-21 16:32:49)
PH8 10mM的离子强度
969 (2013-12-21 16:34:11)
QUOTE:
我做了梯度，pH8的效果也不好yonger (2013-12-21 16:34:39)
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AAT，是从FⅣ里提吗，成分比较复杂，DEAE有难度，建议换其他填料！
969 (2013-12-21 16:35:32)
QUOTE:
AAT是什么？是从Fiv中提取，用DEAE的吸附率不管怎么优化都只有40%-50%左右，那应该使用什么调料比较好呢？Q FF还是别的什么？Q FF我也试过，效果也不好
yonger (2013-12-21 16:36:50)
QUOTE:
不知道你是用什么方法得到这个吸附率40%-50%左右的。
血浆中的低丰度蛋白，估计可能是活性测定的方法。
那么还有两种可能性，一是目标蛋白在吸附和洗脱的过程中失活，二是目标蛋白有一部分与其他蛋白形成结合体从而改变了其电荷性质。
yyaxw84 (2013-12-21 16:37:22)
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