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【求助】蛋白煮后成絮状是什么原因啊？
【求助】蛋白煮后成絮状是什么原因啊？
各位大侠，我的蛋白煮了之后就成块状的了，用枪吹打后也不溶解，成细小的絮状。
不知道是什么原因，我用的是碧云天的P0013B RIPA裂解液，用前加PMSF，匀浆后离心取上清，加上样Buffer（配的）煮5分钟~
请哪为高手指点下啊，本人很着急啊~
万分感激~
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【求助】蛋白煮后成絮状是什么原因啊？
【求助】蛋白煮后成絮状是什么原因啊？
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-12-21 16:40 作者: jiushikeshui371 来源: 分析测试百科网
最新回复
zwsyrt (2013-12-21 16:40:38)
是组织蛋白吗？
很有可能是蛋白浓度过高，先测下蛋白浓度，然后稀释再煮。
abc816 (2013-12-21 16:41:13)
是组织蛋白，用什么稀释呢，裂解液稀释可以吗
龙小好汉 (2013-12-21 16:41:34)
可以，PBS也可以
langlang (2013-12-21 16:42:15)
jiushikeshui371 (2013-12-21 16:42:38)
我用裂解液稀释了下再煮确实好多了，但还是做不出结果
只有一次做出了条带，还是很细的，而且连成一条线
不知道怎么搞的，很郁闷啊
jiushikeshui371 (2013-12-21 16:43:01)
本人做western刚处于初级阶段，做的很不好，也很着急~
希望有高手指点指点
做了好几次，连actin都做不出来，实在没信心了~
zwsyrt (2013-12-21 16:43:30)
QUOTE:
带很细可能是因为你转膜时间还不够，也可能是你的目的蛋白的丰度本来就地，建议富集纯化一下，连成一条线那可能就是你跑胶的时候上样时间太长，造成了扩散，或者是放那里很久没有跑等原因，造成了条带的扩散。这需要你在操作方面下手了。jiushikeshui371 (2013-12-21 16:43:58)
如果是目的蛋白浓度本来就低的话，我增加上样量可以吗
"富集纯化”说的好专业啊，实验室没人做过，恐怕有点困难~
还有为了防止蛋白扩散，电压减小一点可以吗
转膜我用的是200mA，湿转2小时，目的蛋白大小是45，每次看maker都转过去了
zwsyrt (2013-12-21 16:44:17)
如果目的带丰度滴的话增加上样量当然可以。分离胶电压不能太低，太低了跑的时间长也会扩散的，我们一般是半湿转，恒流，大小事胶面积X1.5，时间依蛋白分子量而定，我们转过50至80kDa的分子，转膜时间70min。Good luck ！
dongdongqiang (2013-12-21 16:44:39)
加样不要太慢，加完就开始电泳，100V试试
转膜也100V，2h
祝好运！
jiushikeshui371 (2013-12-21 16:45:08)
蛋白没有定量，直接加的，考虑做actin，就没有买试剂盒测蛋白浓度
分离胶跑100V会不会有点低啊，我一般跑的是120V,稳流
转膜也100V 是稳压还是稳流呢
Ao7 (2013-12-21 16:45:28)
minran_1980 (2013-12-21 16:46:20)
分离胶跑100V会不会有点低啊，我一般跑的是120V,稳流
转膜也100V 是稳压还是稳流呢
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你没有蛋白定量，你知道你的蛋白浓度和上样量是多少ug吗？如果不能保证每孔的上样量一致，即使再做actin也没任何意义：难道你的结果是目的蛋白结果一样，而actin的条带变化各异，然后你扫描后用灰度值去计算变化趋势？比如，你有6个样本，目的蛋白A的信号值分别是500，450，550，520，510，490；然后你的actin分别是100，500，300，1500，3000，然后你去用actin作为参考，结果会如何呢？
第二，不是分子量过高如达到200KD左右，一般电泳用200V,45min；湿转，100V,60min就可以了；当然都是稳压，不需要过分地调整这些电压的条件（这是Bio-Rad 推荐的方法，国产仪器也适用），实验结果的好坏与你从样本制作与胶制备、电泳、转膜、封闭、孵育抗体等过程有关的。
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