【求助】磷酸化的western

最新回复

• dhpbj (2013-12-22 11:48:32)

  
  磷酸化蛋白的western要注意以下两个问题：
  1 蛋白裂解液中应加入磷酸酯酶抑制剂，如Na3VO4,NaF等，以防磷酸化蛋白质去磷酸化；
  2 封闭液及抗体稀释液采用BSA,而不是常规western使用的脱脂奶粉，因为这样的脱脂奶粉含有磷酸化氨基酸，会干扰实验结果。当然，也可以使用经过去磷酸化处理的脱脂奶粉。

• eric930 (2013-12-22 11:49:00)

  
  曾经做出来几次，但每次都是蛋白表达很弱，一抗（1：1000），但背景又很深，调高一抗浓度（1：500）想加大蛋白表达，但背景就更深，不知道该如何调整才能得到理想的条带。

• ha111 (2013-12-22 11:49:38)

  
  裂解液中Na3VO4可以使用3mM，当然蛋白酶抑制剂要加全.
  可以试试添加5mM EDTA 2mM EGTA，可以抑制蛋白裂解过程中的磷酸化，如果你要定量的话。
  主意Na3VO4的制备.

• redbutterfly (2013-12-22 11:59:11)

  好象说磷酸化的用BSA封闭较好一些，那应该是多少浓度呢？也适用TBST稀释吗？那一抗二抗也是用这个稀释吗？阿

• birdfish (2013-12-22 12:00:15)

  最近也正要做磷酸化的WB呢，同样有楼上的疑问，请高手指教。除了用BSA封闭不同外，还有没有与普通的WB有不同之处呢？谢谢了！

• jujuba (2013-12-22 12:00:55)

  磷酸化蛋白的western要注意以下两个问题：
  1 蛋白裂解液中应加入磷酸酯酶抑制剂，如Na3VO4,NaF等，以防磷酸化蛋白质去磷酸化；
  
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  提取蛋白的时作为候，不是加入了PMSF，抑制蛋白酶的作用了吗？是否还有必要特别加入磷酸酯酶抑制剂呢？

• tie8 (2013-12-22 12:01:15)

  
  磷酸基团特别敏感，样品制备最好用液氮研磨，裂解液需要特别加入磷酸酯酶抑制剂
  3%BSA封闭（用TBST稀释）

• yes4 (2013-12-22 12:01:54)

  
  我用的是碧云天的封闭液，不知道是什么配方，不过做的结果还可以。条带比较的亮，但是也是重复了好多次之后才出来的结果。