【求助】Western凝胶问题求助，谢谢！

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• uuooii (2013-12-22 12:04:19)

  可能是分离胶和浓缩胶配制时使用了同样的缓冲液，PH没有差异造成的

• 68943512yao (2013-12-22 12:04:41)

  样品太粘稠，没有去核酸，建议用核酸酶处理下，或者样品浓度太高，用loading buffer稀释一下。还有在跑胶前可以把marker和样品温热一下再点样，因为长时间低温放置有可能导致样品中的SDS沉淀。

• 兔唇 (2013-12-22 12:05:15)

  1、点样时loading似乎很难沉下去——loadingbuffer问题，加长煮样时间，加样前离心，上清点样
  2、蛋白样品在胶中弥散拖尾——看上面的胶，MAKER虽然跑不动，但是条带清晰，如果是纯化后的蛋白，那很有可能是胶的问题或者蛋白里面还有影响电泳的物质，例如高浓度硫酸铵，如果是细胞裂解液，那么是裂解问题，蛋白已经完全降解了。
  3、蛋白Marker跑不动，卡在分离胶和浓缩胶交界的位置——这个不是很清楚，请确定你的胶浓度没问题？加大AP和temed的量基本上不会影响胶的质量的，可能是电泳缓冲液浓度不对？天气冷建议配胶后放水箱里面聚合，这样比加大AP和TEMED效果好很多

• 兔唇 (2013-12-22 12:05:38)

  
  又看了一下，MARKER也有拖尾/n弥散，建议楼主吧电泳+配胶的溶液全部换掉

• wu11998866 (2013-12-22 12:06:19)

  最近做了几次Western，凝胶是10%的。
  出现了一下现象：
  1、点样时loading似乎很难沉下去
  2、蛋白样品在胶中弥散拖尾
  3、蛋白Marker跑不动，卡在分离胶和浓缩胶交界的位置
  （如附件图片所示）
  而夏天时做很顺利。
  考虑一下几个可能：
  1、冬天天气寒冷，凝胶难以凝聚，所以加了2X的AP，TEMED也增加了50%左右的量，导致凝胶不规则，不均匀？
  2、灌浓缩胶之前，水没有吸干净？
  3、蛋白样品制作中有何不妥？
  4、loading质量问题
  哪位高手可以指点一下，感激不尽！
  
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  就是第一个原因，增加了AP的量导致凝胶中离子强度增加，而产生样品弥散、拖尾、被卡在某处等等现象。解决办法是提高环境温度，而不是改变电泳体系的离子强度。

• feima+ (2013-12-22 12:06:58)

  
  上样很难沉降，可以多加点甘油。看图扩散明显，可以适当加大电压。你先试试吧。

• greenbee (2013-12-22 12:07:17)

  1 冬天灌胶难以凝固的问题：你可以把空调打开，或者放在太阳可以照的地方；或者直接放在可以调整温度的地方，我现在就是把胶灌好后放在细菌培养箱里进行凝固（把温度调至30度左右）；
  2 蛋白上样时不易下沉与电泳时拖尾：如果是细胞或组织样本的话，可能是你没有超声破碎DNA；
  3 至于marker不泳动的问题，就比较复杂，有胶的问题，有marker的问题，可以重新配灌胶所用试剂，但从蛋白样本可以泳动的情况来看，灌胶缓冲液PH好象又没太大问题；
  4 冬天胶难凝是个问题，尤其是北方，尽量采用加热的方法加速，不要增加APS与TEMED的量，因为这样增加了分析问题的难度。

• 逗号是句号 (2013-12-22 12:07:40)

  
  蛋白样品在胶中弥散拖尾，蛋白Marker跑不动，应该是配胶的问题，SDS也许你配错了

• huifeng0516 (2013-12-22 12:07:59)

  
  请问楼主用的是什么牌子的电泳槽？

• yyaxw84 (2013-12-22 12:08:18)

  
  BioRad的，具体型号不清楚～